🔴 克罗诺杆菌属（乳粉）
通过 BPW 预增菌、mLST/万古霉素选择性增菌和 CCI 显色琼脂分离，检测乳粉和婴幼儿配方粉中的克罗诺杆菌属（原阪崎肠杆菌）。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 22964:2017
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 8
- 各步骤合计时间: 5 天 18 小时 40 分钟–7 天 18 小时 40 分钟
- 预增菌: 37 ± 1°C，18 ± 2 h，BPW 中
- 选择性增菌: 44 ± 1°C，24 ± 2 h，mLST/万古霉素中
- 分离: 44 ± 1°C，24 ± 2 h，CCI 琼脂上
概述
克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.，原名阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii）是一种条件致病菌，对新生儿和婴儿构成严重威胁，尤其是早产儿和免疫力低下的儿童。克罗诺杆菌感染可导致脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎——新生儿病死率高达 40–80%。主要感染源是受污染的乳粉（婴幼儿配方粉 — PIF）。
PN-EN ISO 22964 标准描述了检测食品中克罗诺杆菌属的水平法，重点针对乳粉、婴幼儿配方粉以及生产这些产品的车间环境样品。方法包括三个阶段：缓冲蛋白胨水（BPW）预增菌、含万古霉素的改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（mLST/万古霉素）选择性增菌，以及显色琼脂（CCI — 克罗诺杆菌显色分离琼脂）分离。
克罗诺杆菌具有特征性的α-葡糖苷酶活性，可水解 CCI 琼脂中的显色底物，形成蓝绿色（或青绿色）菌落。mLST 肉汤中的万古霉素抑制革兰氏阳性菌生长，实现克罗诺杆菌的选择性增菌。
克罗诺杆菌之所以特别危险，是因为它能在低水分活度环境中存活（乳粉、面粉、草本茶）。按（EC）2073/2005 号法规，婴幼儿配方粉必须进行该检验（标准：10 g 中不得检出）。"检出"结果将导致该批产品从市场召回。
方法原理
三阶段法：（1）预增菌 — 25 g 样品加入 225 mL BPW，37°C/18 h 培养 — 使受损细胞复苏。（2）选择性增菌 — 取 0,1 mL 转入 10 mL 含万古霉素的 mLST，44°C/24 h 培养 — 选择克罗诺杆菌（嗜热生长），万古霉素抑制革兰氏阳性菌。（3）分离 — 划线接种于 CCI 显色琼脂（克罗诺杆菌显色分离琼脂），44°C/24 h 培养。克罗诺杆菌产生α-葡糖苷酶，水解显色底物 — 形成蓝绿色菌落。确证：糖发酵、TSA 上黄色色素产生、生化或分子鉴定。
应用领域
- 婴幼儿乳粉（PIF）质量控制 — （EC）2073/2005 号法规
- 婴幼儿配方粉检验
- 乳粉生产车间环境监测
- 婴幼儿配方粉生产原料控制
- 营养补充剂和特殊医学用途食品检验
- 草本茶、淀粉和面粉监测（克罗诺杆菌的宿主环境）
- 生产工艺和清洗系统（CIP）确认
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 预增菌 | 37 ± 1°C，18 ± 2 h，BPW 中 |
| 选择性增菌 | 44 ± 1°C，24 ± 2 h，mLST/万古霉素中 |
| 分离 | 44 ± 1°C，24 ± 2 h，CCI 琼脂上 |
| 分离培养基 | CCI 琼脂（克罗诺杆菌显色分离琼脂） |
| 菌落特征 | 蓝绿色（青绿色）— α-葡糖苷酶活性 |
| 样品量 | 10 × 25 g（PIF 共 250 g） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 22964:2017
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania Cronobacter spp.
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.
分步操作程序
-
样品制备
称取 25 g 乳粉（PIF）于均质袋中。加入 225 mL 预热至 45°C 的缓冲蛋白胨水（BPW）。混匀至溶解。PIF 需检验 10 × 25 g（共 250 g）。
-
BPW 预增菌
将悬液于 37 ± 1°C 培养 18 ± 2 h。复苏阶段 — 受损的克罗诺杆菌细胞恢复生长能力。
-
mLST/万古霉素选择性增菌
取 0,1 mL 增菌液转入 10 mL 含万古霉素（10 mg/L）的 mLST 肉汤。于 44 ± 1°C 培养 24 ± 2 h。
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CCI 琼脂分离
从变黄的 mLST 肉汤划线接种至 CCI 琼脂平板。于 44 ± 1°C 培养 24 ± 2 h。
-
菌落读取
寻找克罗诺杆菌典型菌落 — 蓝绿色（青绿色），直径 1–2 mm。其他肠杆菌科可能长成无色或粉红色菌落。
-
初步确证
挑取至少 5 个典型菌落。传代至 TSA，25°C 培养 48–72 h。克罗诺杆菌形成黄色/黄橙色菌落（产生色素）。
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生化鉴定
用 API 20E、VITEK 2 GN 或分子方法（PCR）确证分离株。克罗诺杆菌：氧化酶（−）、过氧化氢酶（+）、VP（+）、精氨酸双水解酶（−）。
-
报告
结果："在 25 g（或 10 × 25 g）样品中检出/未检出克罗诺杆菌属"。PIF 中检出 = 立即通报监管部门并召回批次。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 37°C 实验室培养箱 | Binder BD 56、Memmert INB 200 | 5 000–18 000 PLN |
| 44°C 实验室培养箱 | Binder BD 56、Memmert INB 200、POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| II 级生物安全柜 | Thermo Scientific MSC-Advantage、ESCO Airstream | 25 000–60 000 PLN |
| 拍击式均质器 | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| 44–47°C 水浴 | Memmert WNB 14、Julabo TW 12 | 3 000–10 000 PLN |
| 实验室高压灭菌器 | Tuttnauer 2540M、Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 缓冲蛋白胨水（BPW） | — | 用于预增菌；蛋白胨、NaCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄；500 g 装 |
| mLST 肉汤（改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤） | — | 选择性肉汤；十二烷基硫酸钠、胰蛋白胨、NaCl；500 g 装 |
| 万古霉素（mLST 补充剂） | 1404-93-9 | 抑制革兰氏阳性菌的抗生素；浓度 10 mg/L；10 瓶装 |
| CCI 琼脂（克罗诺杆菌显色分离琼脂） | — | 含α-葡糖苷酶底物的显色琼脂；克罗诺杆菌菌落呈蓝绿色；500 g 装或 20 皿装 |
| TSA（胰蛋白胨大豆琼脂） | — | 确证用非选择性培养基 — 克罗诺杆菌在 25°C 培养 48–72 h 后产生黄色色素 |
| 生化鉴定试剂盒 API 20E 或 VITEK | — | 用于确证分离株的生化鉴定 |
职业健康与安全
- 克罗诺杆菌 — BSL-2 病原菌，对新生儿和免疫抑制人群尤为危险
- 仅可在 II 级生物安全柜中操作 — 严格遵守无菌操作规程
- 万古霉素 — 可能致敏的抗生素，佩戴手套
- 使用过的材料须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃
- 用 70% 乙醇或 0,5% 次氯酸钠对台面消毒
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 22964:2017 — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.》。
该方法的原理是什么？
三阶段法：（1）预增菌 — 25 g 样品加入 225 mL BPW，37°C/18 h 培养 — 使受损细胞复苏。（2）选择性增菌 — 取 0,1 mL 转入 10 mL 含万古霉素的 mLST，44°C/24 h 培养 — 选择克罗诺杆菌（嗜热生长），万古霉素抑制革兰氏阳性菌。
测量范围和准确度是多少？
预增菌：37 ± 1°C，18 ± 2 h，BPW 中；选择性增菌：44 ± 1°C，24 ± 2 h，mLST/万古霉素中；分离：44 ± 1°C，24 ± 2 h，CCI 琼脂上；分离培养基：CCI 琼脂（克罗诺杆菌显色分离琼脂）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 5 天 18 小时 40 分钟–7 天 18 小时 40 分钟。整个程序共 8 个步骤。
需要哪些设备？
37°C 实验室培养箱、44°C 实验室培养箱、II 级生物安全柜、拍击式均质器、44–47°C 水浴、实验室高压灭菌器。核心仪器的参考价格（37°C 实验室培养箱）：5 000–18 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
婴幼儿乳粉（PIF）质量控制 — （EC）2073/2005 号法规；婴幼儿配方粉检验；乳粉生产车间环境监测；婴幼儿配方粉生产原料控制；营养补充剂和特殊医学用途食品检验；草本茶、淀粉和面粉监测（克罗诺杆菌的宿主环境）；生产工艺和清洗系统（CIP）确认。
需要采取哪些安全防护措施？
克罗诺杆菌 — BSL-2 病原菌，对新生儿和免疫抑制人群尤为危险；仅可在 II 级生物安全柜中操作 — 严格遵守无菌操作规程；万古霉素 — 可能致敏的抗生素，佩戴手套；使用过的材料须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃；用 70% 乙醇或 0,5% 次氯酸钠对台面消毒。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 22964。