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🦠 食品中产气荚膜梭菌

微生物 PN-EN ISO 7937

采用倾注平板法在 TSC（胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸）琼脂上于厌氧条件、37°C 培养 20 ± 2 h 计数食品中的产气荚膜梭菌。

要点速览

  • 标准: PN-EN ISO 7937:2005
  • 类别: 微生物
  • 操作步骤数: 8
  • 各步骤合计时间: 2 天 21 小时 30 分钟
  • 培养温度: 37 ± 1°C
  • 培养时间: 20 ± 2 h
  • 气体环境: 严格厌氧

概述

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是专性厌氧、革兰氏阳性、产芽孢的细菌，在环境中广泛分布（土壤、灰尘、人和动物消化道）。它是最常见的细菌性食物中毒病因之一——美国 CDC 估计每年约有 100 万例。中毒由 CPE 肠毒素（产气荚膜梭菌肠毒素）引起，该毒素在细菌于肠道内形成芽孢时产生。

典型的产气荚膜梭菌中毒发生在食用了储存不当的肉类菜肴（炖菜、肉汁、烤肉）、禽肉和豆类中大量细菌（>10⁶ CFU/g）之后。症状（水样腹泻、腹部绞痛）在食用后 8–22 h 出现，24 h 内消退。产气荚膜梭菌芽孢可耐受烹煮，并在菜肴缓慢冷却（40–50°C）过程中萌发，在最适条件下世代时间仅为 8–10 min。

PN-EN ISO 7937 标准描述了在 TSC（胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸琼脂）培养基上计数产气荚膜梭菌的水平法。培养基含亚硫酸钠——产气荚膜梭菌将亚硫酸盐还原为硫化物，使硫化亚铁沉淀，形成黑色菌落。D-环丝氨酸抑制伴随菌生长。培养在厌氧条件下进行。

确证包括硝酸盐还原试验、动力试验（产气荚膜梭菌无动力）和明胶液化试验。该方法用于即食餐食、餐饮菜肴、肉类及肉制品的质量控制。

方法原理

将样品倾注接种于 TSC（胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸琼脂）培养基，可选择性加入蛋黄乳液。产气荚膜梭菌将亚硫酸钠还原为硫化物，硫化物与铁（II）离子反应生成不溶性黑色硫化铁——菌落呈黑色。D-环丝氨酸抑制伴随菌（尤其是革兰氏阳性需氧菌）生长。若加入蛋黄乳液，产气荚膜梭菌菌落周围会出现乳浊圈（卵磷脂酶活性）。在严格厌氧条件下于 37°C 培养 20 ± 2 h。确证：硝酸盐还原（+）、动力（−）、明胶液化（+）。

应用领域

关键参数

参数数值
培养温度37 ± 1°C
培养时间20 ± 2 h
气体环境严格厌氧
培养基TSC 琼脂（胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸琼脂）
菌落特征黑色，直径 1–5 mm（亚硫酸盐还原为硫化铁）
确证硝酸盐还原（+）、动力（−）、明胶酶（+）

标准

标准编号
PN-EN ISO 7937:2005
标准名称（波兰语）
Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby Clostridium perfringens — Metoda liczenia kolonii
标准名称（英语）
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens — Colony-count technique

分步操作程序

  1. 样品制备

    称取 10 g 样品，加入 90 mL BPW，在拍击式均质器中均质 60–120 s。制备十倍稀释系列。

    ⏱ 时间: 10 min

  2. TSC 培养基制备

    将 TSC 琼脂基础溶于蒸馏水。高压灭菌（121°C/15 min）。冷却至 45–50°C，无菌加入 D-环丝氨酸（必要时加蛋黄乳液）。在 47°C 水浴中保温。

    ⏱ 时间: 30 min • 🌡 温度: 45–50°C

  3. 倾注平板

    将每个稀释度各 1 mL 移入两个无菌培养皿。倾入约 15 mL TSC 培养基（44–47°C）。轻轻混匀。静置凝固。

    ⏱ 时间: 15 min • 🌡 温度: 44–47°C

  4. 覆盖层

    凝固后再加约 10 mL 不含补充剂的 TSC 琼脂。此层限制氧气进入并防止菌落蔓延。

    ⏱ 时间: 10 min

  5. 厌氧培养

    将平板放入厌氧罐（皿底朝上）。放入厌氧产气袋（AnaeroGen）和厌氧指示剂。密闭厌氧罐，于 37 ± 1°C 培养 20 ± 2 h。

    ⏱ 时间: 20 h • 🌡 温度: 37°C

  6. 菌落读取

    计数黑色菌落（直径 1–5 mm）。若加了蛋黄 — 典型菌落周围有乳浊圈（卵磷脂酶 +）。选取 15–150 个菌落的平板计数。

    ⏱ 时间: 15 min

  7. 分离株确证

    挑取至少 5 个典型菌落。厌氧条件下传代至血琼脂（37°C/24 h）。进行：硝酸盐还原（用格里斯试剂呈 +）、SIM 培养基动力试验（−）、明胶肉汤液化试验（+，37°C/48 h）。

    ⏱ 时间: 48 h • 🌡 温度: 37°C

  8. 计算与报告

    结合确证菌落百分比计算产气荚膜梭菌数。结果以 CFU/g 表示。报告表述为"产气荚膜梭菌"。

    ⏱ 时间: 10 min

所需设备与仪器

设备示例参考价格
厌氧系统（厌氧罐 + 产气袋）Oxoid AnaeroJar 2,5 L + AnaeroGen、Merck Anaerocult A500–2 000 PLN（罐）+ 300–500 PLN/10 袋
37°C 实验室培养箱Binder BD 56、Memmert INB 200、POL-EKO CLN 535 000–18 000 PLN
II 级生物安全柜Thermo Scientific MSC-Advantage、ESCO Airstream AC225 000–60 000 PLN
拍击式均质器Seward Stomacher 400 Circulator12 000–25 000 PLN
44–47°C 水浴Memmert WNB 14、Julabo TW 123 000–10 000 PLN
实验室高压灭菌器Tuttnauer 2540M、Systec VX-6515 000–45 000 PLN

试剂、培养基与耗材

试剂CAS详情
TSC 琼脂基础（胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸）7681-57-4胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、亚硫酸钠、柠檬酸铁铵、琼脂；500 g 装
D-环丝氨酸（选择性补充剂）68-41-7抑制伴随菌生长的抗生素；浓度 400 mg/L；10 瓶装
蛋黄乳液（可选）—检测产气荚膜梭菌卵磷脂酶活性 — 菌落周围乳浊圈；50 mL/L
亚硫酸钠7757-83-7被产气荚膜梭菌还原为硫化物；TSC 组分
柠檬酸铁铵1185-57-5提供与硫化物反应的铁离子 — 形成黑色菌落；TSC 组分
厌氧产气袋—Oxoid AnaeroGen 2,5 L 或 Merck Anaerocult A；10 个装
明胶肉汤和格里斯试剂—用于确证试验：明胶酶和硝酸盐还原
缓冲蛋白胨水（BPW）—用于样品稀释，500 g 装

职业健康与安全

常见问题

该检测依据哪项标准？

该检测依据的标准为 PN-EN ISO 7937:2005 — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens — Colony-count technique》。

该方法的原理是什么？

将样品倾注接种于 TSC（胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸琼脂）培养基，可选择性加入蛋黄乳液。产气荚膜梭菌将亚硫酸钠还原为硫化物，硫化物与铁（II）离子反应生成不溶性黑色硫化铁——菌落呈黑色。

测量范围和准确度是多少？

培养温度：37 ± 1°C；培养时间：20 ± 2 h；气体环境：严格厌氧；培养基：TSC 琼脂（胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸琼脂）。

完成检测需要多长时间？

各步骤所列时间合计约为 2 天 21 小时 30 分钟。整个程序共 8 个步骤。

需要哪些设备？

厌氧系统（厌氧罐 + 产气袋）、37°C 实验室培养箱、II 级生物安全柜、拍击式均质器、44–47°C 水浴、实验室高压灭菌器。核心仪器的参考价格（厌氧系统（厌氧罐 + 产气袋））：500–2 000 PLN（罐）+ 300–500 PLN/10 袋。

该检测用于哪些场景？

即食餐食和餐饮菜肴质量控制；肉类及肉制品检验（炖菜、烤肉、肉汁）；餐饮企业和食堂监测；机构供餐控制（医院、学校、养老院）；豆类及其制品检验；食物中毒暴发的流行病学调查；冷却与复热工序验证（HACCP）。

需要采取哪些安全防护措施？

产气荚膜梭菌 — 产毒素和芽孢的 BSL-2 病原菌，须使用全套个人防护装备；厌氧条件 — 打开厌氧罐时须小心（氧气骤然进入）；D-环丝氨酸 — 抗生素，大剂量有神经毒性，避免吸入和皮肤接触；必须在 II 级生物安全柜中操作；使用过的材料须高压灭菌（121°C/30 min）— 芽孢需要更长灭菌时间；亚硫酸钠 — 可能释放 SO₂，房间须通风。

哪家实验室可以开展此项检测？

该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 7937。

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