🦠 水中产气荚膜梭菌
以膜过滤法在 TSC 培养基厌氧条件下定量测定水中产气荚膜梭菌的繁殖体与芽孢。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 14189:2016
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 11
- 各步骤合计时间: 1 天 4 小时 17 分钟
- 结果: cfu/100 mL（菌落形成单位）
- 限值（饮用水）: 0 cfu/100 mL（含芽孢）
- 培养温度: 44 ± 1 °C
概述
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是厌氧、产芽孢的革兰氏阳性菌，其在水中的出现专指粪便污染。C. perfringens 芽孢对化学消毒（氯化、臭氧化）、紫外辐射、pH 与温度变化具极强抵抗力 —— 可在水环境中存活数月甚至数年。
正因这种特殊抵抗力，C. perfringens 成为 E. coli 与肠球菌之外有价值的补充指标。在处理后水中检出其芽孢，表明过滤工艺效能不足，并可能提示陈旧粪便污染 —— 即使此时 E. coli 与肠球菌已检不出。
按 PN-EN ISO 14189 的方法包括：水样膜过滤、将滤膜置于 TSC 培养基（胰蛋白胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂）上，并在厌氧条件下于 44±1 °C 培养 21±3 小时。C. perfringens 将亚硫酸盐还原为硫化物，后者与培养基中的铁盐反应生成黑色菌落。环丝氨酸可抑制芽孢杆菌属的生长。
按卫生部条例，C. perfringens 是饮用水的指示性指标。若在处理后水中检出，应评估过滤工艺效能并核查水厂的屏障体系。
方法原理
水样（或其稀释液）经 0,45 µm 滤膜过滤，滤膜置于 TSC 培养基（胰蛋白胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂）表面。培养基含亚硫酸钠（Na₂SO₃）与柠檬酸铁铵 —— C. perfringens 将亚硫酸盐还原为硫化物（S²⁻），后者与铁离子生成黑色 FeS 沉淀，形成特征性黑色菌落。环丝氨酸（400 mg/L）可选择性抑制芽孢杆菌属。在厌氧条件下（配产气袋的厌氧罐）于 44±1 °C 培养，可进一步提高对 C. perfringens 的选择性。
应用领域
- 饮用水质量控制 —— 指示性指标（卫生部条例）
- 水厂过滤工艺效能评价
- 地下水陈旧粪便污染的发现
- 作为饮用水源的地表水监测
- 供水管网事故后的水质检测
- 水厂膜系统（UF、NF）完整性评价
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 结果 | cfu/100 mL（菌落形成单位） |
| 限值（饮用水） | 0 cfu/100 mL（含芽孢） |
| 培养温度 | 44 ± 1 °C |
| 培养时间 | 21 ± 3 小时 |
| 培养条件 | 厌氧 |
| 取样量 | 100 mL（标准） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 14189:2016
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Clostridium perfringens — Metoda filtracji membranowej
- 标准名称（英语）
- Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens — Method using membrane filtration
分步操作程序
-
工作台准备
对过滤装置灭菌，准备含环丝氨酸添加剂的 TSC 平板，检查培养箱温度（44 °C）。
-
样品预热（可选）
仅测芽孢时：在 75 °C 水浴中加热样品 15 分钟以杀灭繁殖体。测繁殖体 + 芽孢时跳过此步。
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中和余氯
向自来水样品中加入硫代硫酸钠并混匀。
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膜过滤
将 100 mL 样品经 0,45 µm 滤膜过滤，用无菌蛋白胨水冲洗滤杯。
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置于 TSC 培养基
用无菌镊子将滤膜移至 TSC 培养基表面，再浇一薄层 TSC 培养基（覆盖 5 mL）以在表面形成厌氧条件。
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厌氧培养
将平板放入厌氧罐，放入 AnaeroGen 产气袋与指示条，密封后于 44±1 °C 培养 21±3 小时。
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判读结果
打开厌氧罐后 30 分钟内计数黑色菌落 —— 接触空气后颜色会很快消退！黑色／灰色菌落为推定 C. perfringens。
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确认 —— 酸性磷酸酶试验
将菌落点在滤纸上，滴加酸性磷酸酶试剂（α-萘基磷酸盐）。1–2 分钟内呈粉红色 = 酸性磷酸酶阳性 = 确认为 C. perfringens。
-
血琼脂传代（可选）
将菌落转接到血琼脂上，37 °C 厌氧培养 24 小时。C. perfringens 呈双环溶血（β 溶血）。
-
结果计算
结果 = 确认的黑色菌落数 / 取样体积 × 100，以 cfu/100 mL 报告。
-
质量控制
阳性对照：C. perfringens ATCC 13124；阴性对照：无菌水；并检查厌氧指示条。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 膜过滤装置 | Sartorius Combisart、Merck EZ-Fit | 3 000–12 000 PLN |
| 2,5 L 厌氧罐 | Oxoid AG0025A、Merck Anaerocult | 800–2 000 PLN |
| 厌氧产气袋 | Oxoid AnaeroGen AN0025A、Merck Anaerocult A | 50–100 PLN/个 |
| 44 °C 培养箱 | Binder BD 56、Memmert IN30plus | 6 000–18 000 PLN |
| 真空泵 | KNF Laboport N 810 | 3 000–8 000 PLN |
| 高压灭菌器 | Tuttnauer ELV 2540 | 20 000–45 000 PLN |
| 放大镜／菌落计数器 | Stuart SC6+、Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| TSC 琼脂（胰蛋白胨-亚硫酸盐-环丝氨酸） | — | 不含卵黄的选择性培养基。成分：酪蛋白水解物、酵母浸粉、亚硫酸钠、柠檬酸铁铵、琼脂。厂商：Oxoid、Merck、Biokar |
| 环丝氨酸添加剂 | 68-41-7 | D-环丝氨酸，终浓度 400 mg/L，抑制芽孢杆菌属生长 |
| 0,45 µm 滤膜 | — | MCE，47 mm，无菌。Merck Millipore、Sartorius |
| AnaeroGen 产气袋 | — | 2,5 L 厌氧罐用产气袋，30 分钟内可将 O₂ 降至 <1% |
| 厌氧指示条 | — | Oxoid Anaerobic Indicator BR0055 —— 用于检查罐内厌氧状态 |
| 酸性磷酸酶试剂 | — | α-萘基磷酸盐溶液 + 重氮试剂，用于 C. perfringens 确认（酸性磷酸酶阳性） |
| 血琼脂（含 5% 羊血的营养琼脂） | — | 用于传代与溶血性 C. perfringens 的确认 |
| 硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃） | 7772-98-7 | 中和自来水样品中的氯 |
职业健康与安全
- C. perfringens 会产生毒素（α、β、ε、ι）—— 属潜在危险病原体，须全套个人防护
- 厌氧条件下作业 —— 罐内带压，开启时须小心
- 环丝氨酸 —— 属抗生素，避免接触皮肤，须戴手套操作
- 叠氮化钠（培养基中）—— 剧毒，不得酸化（会释放有毒的 HN₃）
- 感染性材料 —— 处置前 121 °C/30 分钟高压灭菌
- 酸性磷酸酶试剂 —— 有刺激性，在通风柜中使用
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 14189:2016 — 《Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens — Method using membrane filtration》。
该方法的原理是什么？
水样（或其稀释液）经 0,45 µm 滤膜过滤，滤膜置于 TSC 培养基（胰蛋白胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂）表面。培养基含亚硫酸钠（Na₂SO₃）与柠檬酸铁铵 —— C.
测量范围和准确度是多少？
结果：cfu/100 mL（菌落形成单位）；限值（饮用水）：0 cfu/100 mL（含芽孢）；培养温度：44 ± 1 °C；培养时间：21 ± 3 小时。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 1 天 4 小时 17 分钟。整个程序共 11 个步骤。
需要哪些设备？
膜过滤装置、2,5 L 厌氧罐、厌氧产气袋、44 °C 培养箱、真空泵、高压灭菌器、放大镜／菌落计数器。核心仪器的参考价格（膜过滤装置）：3 000–12 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
饮用水质量控制 —— 指示性指标（卫生部条例）；水厂过滤工艺效能评价；地下水陈旧粪便污染的发现；作为饮用水源的地表水监测；供水管网事故后的水质检测；水厂膜系统（UF、NF）完整性评价。
需要采取哪些安全防护措施？
C. perfringens 会产生毒素（α、β、ε、ι）—— 属潜在危险病原体，须全套个人防护；厌氧条件下作业 —— 罐内带压，开启时须小心；环丝氨酸 —— 属抗生素，避免接触皮肤，须戴手套操作；叠氮化钠（培养基中）—— 剧毒，不得酸化（会释放有毒的 HN₃）；感染性材料 —— 处置前 121 °C/30 分钟高压灭菌；酸性磷酸酶试剂 —— 有刺激性，在通风柜中使用。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 14189。