🦠 食品、饲料、环境样品和初级生产样品中的亚硫酸盐还原梭菌——亚硫酸铁琼脂倾注平板加覆盖层，37 °C厌氧培养48 h，菌落确认，可选择在80 °C处理10 min后仅计芽孢，PN-EN ISO 15213-1

微生物 PN-EN ISO 15213-1

概述

该标准的内容。PKN目录卡上的范围，全文（我们的翻译）：“本文件规定了用菌落计数技术对亚硫酸盐还原厌氧菌以及梭菌属（Clostridium spp.）亚硫酸盐还原细菌进行计数的方法。本标准适用于：——供人类食用的产品；——用于动物饲养的产品；——食品和饲料生产、经营区域的环境样品，以及——来自初级生产阶段的样品。注 该方法已在实验室间研究中针对以下食品类别进行了验证：——即食、即热肉制品；——蛋和蛋制品（衍生物）；——加工水果和蔬菜；——婴儿配方食品和婴儿谷物；——多组分食品或餐食组分。它还针对以下其他产品类别进行了验证：——宠物食品和动物饲料；——环境样品（取自食品或饲料生产环境）。该方法已针对至少五个食品类别进行验证，因此适用于广泛的食品。关于验证的详细信息见第11章和附录C。由于该方法不常用于初级生产阶段的样品，该类别未纳入验证研究。因此没有获得该类别的相应验证参数值。所述方法适用于（但不限于）对被检样品中的微生物进行计数，并以每个平板至少计数10个菌落为基础。这相当于液体样品的污染水平应高于10 cfu/ml，固体样品应高于100 cfu/g。”ISO英文文本第一句只提到亚硫酸盐还原梭菌。我们有ISO 15213-1:2023（第一版）从封面到第9.4.4条的样本摘录（第5页）。

按2023版（前言、引言、第1–9.4.4章）。本标准由ISO/TC 34/SC 9“Microbiology”与CEN/TC 463合作编制（维也纳协议）；它取代了ISO 15213:2003，其变化被视为重大变化（按ISO 17468），对方法的性能特性有重大影响：范围扩大到初级生产样品；测定对象从“亚硫酸盐还原细菌”改为“亚硫酸盐还原梭菌”，因此要对典型菌落进行确认；亚硫酸铁琼脂中的亚硫酸盐含量从1.0 g/l降至0.5 g/l；80 °C加热10 min改为可选（背景菌群多时或仅计数芽孢时）；删除了用试管接种以及在50 °C培养嗜热亚硫酸盐还原菌的选项；增加了确认的描述、附录A中的新流程图、附录C中的性能特性以及附录D中的饲料专用规程。引言：亚硫酸盐还原梭菌是专性厌氧、革兰氏阳性、产芽孢的杆菌——包括产气荚膜梭菌、双酶梭菌、生孢梭菌、肉毒梭菌——是污染指示菌；产气荚膜梭菌的计数见ISO 15213-2，其检测见ISO/TS 15213-3。原理（第4章）：将规定量的液体样品或初始悬液在空平皿中与熔化的琼脂混合（倾注平板），凝固后倾注覆盖层以防止菌落蔓延；平板在37 °C厌氧培养48 h，计数典型菌落——黑色或灰色至黄褐色，其颜色来自硫离子与培养基中三价铁反应生成的硫化亚铁；对典型菌落进行确认；注：未经确认时，结果可报告为“厌氧亚硫酸盐还原细菌”。当数量接近测定限时，最好做双平板——两个平板的菌落总数至少10个，相当于大于5 cfu/ml或50 cfu/g。结果以每克、每毫升、每平方厘米或每个采样器具的cfu表示。设备（第6章）：氧气低于1 %、二氧化碳9 %至13 %的厌氧环境（厌氧罐、厌氧箱或产气袋），培养箱37 °C ± 1 °C，pH计25 °C时± 0.1，冰箱5 °C ± 3 °C，10 ml和1 ml吸管，约1 µl接种环，约90 mm的平皿以及可选的约140 mm平皿，44–47 °C和80 °C ± 2 °C水浴。采样不属于本方法——推荐文件：ISO/TS 17728（食品和饲料）、ISO 707（乳）、ISO 6887-3、ISO 13307（初级生产）、ISO 17604（胴体）、ISO 18593（表面）；制备按ISO 6887系列，饲料按附录D。仅计芽孢（9.3）：将稀释系列在80 °C水浴中加热10 min ± 1 min，最迟在制备初始悬液后15 min内进行（否则在融冰中最多放置2 h）；用参比瓶中的温度计监测温度；升至80 °C不超过5 min（水位至少高出样品4 cm，循环泵），计时从参比瓶达到80 °C开始，随后迅速冷却到约20 °C；加热还能减少背景菌群（例如液态乳清、青贮饲料）。接种（9.4）：在两个90 mm平皿中各加入1 ml液体样品或初始悬液（10⁻¹），在另一个平皿中加入1 ml下一个稀释度——10⁻¹（液体）或10⁻²（其他）；检查10 ml初始悬液、分装于三个140 mm平皿，可使测定限降低十倍；选择每个90 mm平皿10至150个菌落或每个140 mm平皿10至360个菌落的稀释度。

状态（目录卡状态截至2026年9月30日）。PN-EN ISO 15213-1:2023-08（英语版）目录卡没有“已废止”标题——该标准为现行标准：发布于08-08-2023，34页，价格组Q，食品、农业和林业部门，KT 3食品链微生物技术委员会，ICS 07.100.30，“采用：EN ISO 15213-1:2023 [IDT]，ISO 15213-1:2023 [IDT]”，“替代：PN-ISO 15213:2005 - 波兰语版”，更正Ap1:2024-02。国家更正PN-EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02（2024年2月22日批准，已阅读目录卡上的文件）在封面“替代”栏中增加了PN-ISO 15213:2005，并在国家前言中增加了“本标准替代PN-ISO 15213:2005”一句。PN-ISO 15213:2005《食品和动物饲料微生物学——厌氧条件下生长的亚硫酸盐还原细菌计数的水平方法》目录卡——“已废止并被PN-EN ISO 15213-1:2023-08替代”：发布于29-06-2005，“废止日期：23-02-2024”，12页，曾采用ISO 15213:2003，替代了PN-A-86034-12:1993。PKN搜索“PN-EN ISO 15213”（2026年9月30日）：PN-EN ISO 15213-1:2023-08和PN-EN ISO 15213-2:2024-05没有标签，PN-ISO 15213:2005——“已废止并被替代”，以及另一领域（交通系统）的PN-EN 15213-1…5标准。

有多少实验室、以何种形式（认可范围数据库副本，数据截至2026年9月17日，2026年9月30日读取）。编号15213-1的全部写法：10家实验室的11条记录；在现行PCA文件中，该编号出现在13个单元格中——AB 924在2026年9月16日第25版中有三个项目，副本中只有一个。写法“PN-EN ISO 15213-1:2023-08”——8家实验室，其中带更正Ap1:2024-02的有AB 285、AB 313、AB 370、AB 819、AB 924（AB 285写作“PN_EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02”）；AB 400写作“PN-EN ISO 15213-1”，在第二个项目中写作“PN-ISO 15213-1”，AB 1179——“PN-ISO 15213-1:2023-08”（PKN目录中不存在的形式）；AB 370引用该标准“不含第9.6条”（确认）。“实验室”标签页查找以“PN-EN ISO 15213-1”开头的写法，将显示9家实验室——不会显示AB 1179；已于2026年9月30日在生产服务器labcoda.pl上用该标签页的查询核对：9（在“PN-ISO 15213-1”下——2）。PCA网站上的现行认可范围（2026年9月30日读取，版本日期从2025年10月30日到2026年9月16日）：含本标准的项目未被暂停（AB 1179有认可范围的另一部分被暂停）。

测定量和对象。测定量名称：“亚硫酸盐还原梭菌计数”——7家实验室（AB 285、AB 313、AB 400、AB 452、AB 462、AB 924、AB 1415）；“厌氧亚硫酸盐还原细菌计数”——AB 819；“厌氧亚硫酸盐还原细菌芽孢计数”——AB 370；“厌氧条件下生长的亚硫酸盐还原细菌计数”——AB 1179（已废止的PN-ISO 15213:2005标题的措辞）。技术：平板法，倾注平板——9家实验室，AB 452——“水平方法”。对象：食品——乳和乳制品、肉和肉制品、鱼、水果和蔬菜及其制品、浓缩食品、糖果、谷物制品、蛋、冷冻食品、即食菜肴（AB 285还有苹果汁）；AB 400——灵活范围内的食品。项目没有数值范围。

与本标准并列的方法。已废止的PN-ISO 15213:2005仍在三家实验室的现行认可范围中：AB 285（两个项目——厌氧亚硫酸盐还原细菌及其芽孢——在按新标准的项目旁，2026年1月13日第28版）、AB 418（废物中的厌氧菌芽孢，包括亚硫酸盐还原菌）和AB 1866（植物栽培辅助物中厌氧亚硫酸盐还原微生物计数，2026年6月9日第4版）。按PN-A-82055-12对“厌氧产芽孢细菌和厌氧亚硫酸盐还原细菌是否存在”的定性检验，在现行认可范围中由5家实验室开展（AB 400、AB 462、AB 483、AB 510、AB 1415；副本中还有AB 437，但其2026年9月10日版已不含该项目）。水中亚硫酸盐还原梭菌芽孢按PN-EN 26461-2用膜过滤法计数，食品中产气荚膜梭菌计数按PN-EN ISO 15213-2（两者在知识库中都有单独条目）。

容易得到表面正确结果的地方。第一——是否确认：结果“亚硫酸盐还原梭菌”需要对典型菌落进行确认；未经确认时，标准只允许报告“厌氧亚硫酸盐还原细菌”——AB 370排除第9.6条，并将测定量称为“厌氧亚硫酸盐还原细菌芽孢”。第二——芽孢还是营养细胞：80 °C加热10 min是可选的；加热后的结果只涉及芽孢，与未加热的结果不可比较——报告必须说明。第三——新旧方法：2023版培养基的亚硫酸盐含量较低（0.5 g/l而非1.0 g/l），没有50 °C培养，也没有试管接种——按已废止的PN-ISO 15213:2005得出的结果与按本标准的结果不可互换。第四——下限：计数要求每个平板至少10个菌落——大于10 cfu/ml或100 cfu/g；两个平板时合计至少10个——大于5 cfu/ml或50 cfu/g；更低水平需要将10 ml悬液接种在140 mm平皿上。第五——厌氧：整个培养期间氧气低于1 %；厌氧罐漏气时菌落会减少。

我们不提供的内容。摘录止于第9.4.4条：我们不提供后续接种和倾注覆盖层的过程（9.4.5起）、典型菌落计数（9.5）、确认（9.6）、结果表示（10）、验证数据（11，附录C）、培养基成分（附录B）或饲料规程（附录D）。

方法原理

将液体样品或初始悬液及其稀释液在平皿中与熔化的亚硫酸铁琼脂混合，凝固后加覆盖层，在37 °C厌氧培养48 h。亚硫酸盐还原梭菌形成黑色或灰色至黄褐色菌落（硫化亚铁）；计数并确认典型菌落，结果以cfu/g、cfu/ml、cfu/cm²或每个采样器具表示。仅计芽孢时，将稀释液在80 °C加热10 min。

应用领域

• 食品——乳和乳制品、肉、鱼、水果和蔬菜、浓缩食品、糖果、谷物制品、蛋、冷冻食品——在10家实验室的认可范围中
• 饲料和宠物食品、食品和饲料生产环境样品、初级生产样品——按标准的范围

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 15213-1:2023-08 (wersja angielska; EN ISO 15213-1:2023, ISO 15213-1:2023 IDT) z poprawką PN-EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02

标准名称（波兰语）

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Clostridium spp. — Część 1: Oznaczanie liczby Clostridium spp. redukujących siarczany(IV) metodą liczenia kolonii

标准名称（英语）

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 1: Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by colony-count technique

分步操作程序

1. 样品和稀释

   按ISO 6887系列制备（饲料——附录D）；一个十倍稀释系列。PN-EN ISO 15213-1:2023-08为现行标准（目录卡状态截至2026年9月30日）。

2. 仅计芽孢（可选）

   在80 °C水浴中加热稀释液10 min ± 1 min，最迟在制备悬液后15 min；升至80 °C ≤ 5 min；冷却到约20 °C。

3. 倾注平板

   在两个90 mm平皿中各加入1 ml液体样品或10⁻¹悬液，在另一个平皿中加入1 ml下一个稀释度；低水平时将10 ml悬液分装于三个140 mm平皿；亚硫酸铁琼脂和覆盖层。

4. 培养

   厌氧（< 1 % O₂，9–13 % CO₂），37 °C，48 h。

5. 计数、确认、结果

   在有10–150个菌落的平板（90 mm）上计数黑色或灰色至黄褐色菌落；确认典型菌落（9.6——不提供）；未经确认时结果报告为“厌氧亚硫酸盐还原细菌”。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 培养物可能含有致病梭菌（产气荚膜梭菌、肉毒梭菌）——仅在配备适当设施的实验室、在微生物专家监督下进行，并安全处置培养后的材料（标准的警告）
• 专业提示：未经菌落确认时结果为“厌氧亚硫酸盐还原细菌”，而不是梭菌属；按已废止的PN-ISO 15213:2005得出的结果与按本标准的结果不可互换

常见问题