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🦠 食品和饲料中的Clostridium perfringens（产气荚膜梭菌）——TSC琼脂倾注加覆盖层接种（37 °C，20 h，厌氧）

微生物 PN-EN ISO 15213-2

三句话速览

取1 ml样品或稀释液倾注接种于胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC）中，覆以同种琼脂的覆盖层，并在37 °C下厌氧培养20 h ± 2 h；在菌落数 < 150的平板上计数黑色或灰色至黄褐色的菌落并加以确证（酸性磷酸酶试验、SIM培养基）。该检测依据 PN-EN ISO 15213-2:2024-05 (ISO 15213-2:2023)；培养：37 °C ± 1 °C，20 h ± 2 h，厌氧条件，平板倒置；取出后30 min内计数。整个程序共 8 个步骤；主要用于：即食和需复热的肉制品、多组分菜肴、餐饮配餐——食物中毒的指示菌、蛋和蛋制品、加工果蔬、婴儿配方食品和米糊（已验证的类别）、饲料和宠物食品、食品与饲料生产的环境样品、初级生产。

要点速览

  • 标准: PN-EN ISO 15213-2:2024-05 (ISO 15213-2:2023)
  • 类别: 微生物
  • 操作步骤数: 8
  • 培养: 37 °C ± 1 °C，20 h ± 2 h，厌氧条件，平板倒置；取出后30 min内计数
  • 接种: 每块平板1 ml样品／悬液（2块平板），稀释液10⁻¹（液体）或10⁻²（其他）；12–15 ml TSC（90 mm）+ 约5 ml覆盖层
  • 琼脂的温度平衡: 44–47 °C

概述

ISO 15213-2:2023规定了用菌落计数法测定Clostridium perfringens（产气荚膜梭菌）的数量。它适用于供人食用的产品、饲料、食品和饲料生产与流通环节的环境样品以及初级生产的样品。该方法在实验室间研究中针对即食和需复热的肉制品、蛋和蛋制品、加工果蔬、婴儿配方食品和米糊以及多组分食品，还有宠物食品、饲料和环境样品进行了验证——由于涵盖了至少五个类别，它适用于广泛的食品（第11章，附录C）。在本版中，80 °C 10 min的热处理已改为可选（用于伴随菌群数量高的情形）；附录D描述了在分子水平区分对人致病与非致病C. perfringens菌株的方法。

当预期的CFU数接近定量限时，建议采用双平板（两块平板上的菌落总数 ≥ 10，相当于液体 > 5 CFU/ml或固体产品 > 50 CFU/g的污染水平）。倾注加覆盖层接种对于预期会出现蔓延菌落、遮盖目标菌落的产品尤其适用。在波兰它以PN-EN ISO 15213-2:2024-05（英文版）施行。加有D-环丝氨酸添加剂的胰胨-亚硫酸盐琼脂（TSC）在波兰有商品培养基供应（粉剂、瓶装、平板）。

方法原理

把规定量的液体样品或（对其他产品而言）初始悬液置于空培养皿中，与熔化的琼脂培养基混合（倾注平板）；后续平板用按ISO 6887系列制备的十倍稀释液制备。凝固后铺上同种琼脂的覆盖层，以防止蔓延菌落的生长。如果只计数芽孢，则在接种前把稀释系列在80 °C下加热10 min ± 1 min（在水浴中，自制备悬液起15 min内进行，否则把试管置于融冰中至多2 h；达到80 °C的时间 ≤ 5 min；加热后立即冷却至约20 °C）。向两块平板（约90 mm）中各移入1 ml液体样品或初始悬液（预期数量少时可把限值降低10倍，检验10 ml），向下一块中移入1 ml 10⁻¹稀释液（液体产品）或10⁻²稀释液（其他产品），依此类推，至少选取两个连续的关键稀释度。倒入12–15 ml（90 mm平板）或30–35 ml（140 mm）熔化并温度平衡至44–47 °C的TSC琼脂，旋转混匀，凝固后铺上约5 ml（90 mm）或12 ml（140 mm）TSC琼脂作为覆盖层。平板倒置于厌氧气氛中在37 °C下培养20 h ± 2 h；从厌氧气氛中取出后30 min内，在含推定菌落 < 150个的平板（90 mm）上计数典型菌落——黑色或灰色至黄褐色，其颜色连同周围的环带来自由硫离子与培养基中所含铁(III)生成的硫化铁(II)。确证：从每块平板挑取5个菌落转接到非选择性血琼脂（或营养琼脂）上，在37 °C下厌氧培养20 h ± 2 h（读数前平板可在5 °C下冷藏至多48 h），随后进行酸性磷酸酶试验（把菌落在加有试剂的滤纸上研开；3–4 min内出现紫色 = 阳性）以及亚硫酸盐-吲哚-动力琼脂试验（SIM，在37 °C下22 h ± 2 h：亚硫酸盐还原、吲哚、动力）。结果按每一样品体积中经确证的C. perfringens数计算；附录D可用于在分子水平区分对人致病的菌株。

应用领域

关键参数

参数数值
培养37 °C ± 1 °C，20 h ± 2 h，厌氧条件，平板倒置；取出后30 min内计数
接种每块平板1 ml样品／悬液（2块平板），稀释液10⁻¹（液体）或10⁻²（其他）；12–15 ml TSC（90 mm）+ 约5 ml覆盖层
琼脂的温度平衡44–47 °C
芽孢的选择（可选）80 °C ± 2 °C下10 min ± 1 min，自制备悬液起15 min内；达到80 °C的时间 ≤ 5 min；冷却至约20 °C
计数与确证推定菌落 < 150个的平板；每块平板5个菌落：血琼脂厌氧20 h ± 2 h、酸性磷酸酶（3–4 min）、SIM 22 h ± 2 h
限值（双平板）总数 ≥ 10个菌落；> 5 CFU/ml（液体）或 > 50 CFU/g（固体）

标准

标准编号
PN-EN ISO 15213-2:2024-05 (ISO 15213-2:2023)
标准名称（波兰语）
Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Clostridium spp. — Część 2: Oznaczanie liczby Clostridium perfringens metodą liczenia kolonii
标准名称（英语）
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count technique

分步操作程序

  1. 称样、悬液和稀释液

    按ISO 6887系列制备初始悬液和十倍稀释液。

  2. 可选的芽孢选择

    如果只计数芽孢：把稀释系列在80 °C水浴中加热10 min ± 1 min（以参比样品达到80 °C时开始计时；升温 ≤ 5 min），并在制备悬液后15 min内进行（否则置于融冰中至多2 h）；随后立即冷却至约20 °C。

  3. 接种

    向两块90 mm平板中各移入1 ml液体样品或初始悬液（预期数量少时——10 ml，限值降低10倍）；向下一块平板中移入1 ml 10⁻¹稀释液（液体）或10⁻²稀释液（其他产品）；用新的移液管以后续稀释液重复上述操作，至少选取两个连续的关键稀释度。

  4. 倾注接种与覆盖层

    倒入12–15 ml（90 mm）或30–35 ml（140 mm）温度平衡至44–47 °C的TSC琼脂，旋转混匀并静置凝固；随后铺上约5 ml（90 mm）或12 ml（140 mm）TSC琼脂作为覆盖层。

  5. 厌氧培养

    把平板倒置，在厌氧气氛中于37 °C下培养20 h ± 2 h。

  6. 典型菌落的计数

    从厌氧气氛中取出后30 min内，在推定菌落 < 150个的平板上计数黑色或灰色至黄褐色的菌落。

  7. 确证

    从每块平板挑取5个菌落，接种于血琼脂（或营养琼脂）并在37 °C下厌氧培养20 h ± 2 h（培养结束后立即读数；平板可在5 °C下冷藏至多48 h）。进行酸性磷酸酶试验（3–4 min内出现紫色 = 阳性）和SIM试验（22 h ± 2 h，37 °C）。

  8. 结果

    计算每克或每毫升样品中经确证的C. perfringens数；必要时采用附录D的方法区分对人致病的菌株。

所需设备与仪器

设备示例参考价格
培养箱37 °C ± 1 °C和厌氧培养系统（厌氧罐／厌氧箱）培养TSC平板和转接平板—
恒温水浴44–47 °C以及80 °C ± 2 °C琼脂的温度平衡；芽孢的热处理—
冷冻箱−20 °C ± 2 °C和−70 °C ± 3 °C、冷藏箱5 °C ± 3 °C保存菌株和平板（读数前至多48 h）—
无菌移液管10 ml、1 ml和0.1 ml，接种环接种和转接—
约90 mm（或140 mm）培养皿倾注加覆盖层接种—
在25 °C下校准准确度为 ± 0.1 pH的pH计培养基pH的控制—

试剂、培养基与耗材

试剂CAS详情
含D-环丝氨酸的胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC）—选择性倾注培养基和覆盖层；生成硫化铁(II)的黑色菌落
按ISO 6887系列的稀释液—初始悬液和十倍稀释液
非选择性血琼脂或营养琼脂—转接菌落以供确证
酸性磷酸酶试验试剂—确证——3–4 min内出现紫色
亚硫酸盐-吲哚-动力琼脂（SIM）—确证——亚硫酸盐还原、吲哚、动力

职业健康与安全

常见问题

该检测依据哪项标准？

该检测依据的标准为 PN-EN ISO 15213-2:2024-05 (ISO 15213-2:2023) — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count technique》。

该方法的原理是什么？

把规定量的液体样品或（对其他产品而言）初始悬液置于空培养皿中，与熔化的琼脂培养基混合（倾注平板）；后续平板用按ISO 6887系列制备的十倍稀释液制备。凝固后铺上同种琼脂的覆盖层，以防止蔓延菌落的生长。

测量范围和准确度是多少？

培养：37 °C ± 1 °C，20 h ± 2 h，厌氧条件，平板倒置；取出后30 min内计数；接种：每块平板1 ml样品／悬液（2块平板），稀释液10⁻¹（液体）或10⁻²（其他）；12–15 ml TSC（90 mm）+ 约5 ml覆盖层；琼脂的温度平衡：44–47 °C；芽孢的选择（可选）：80 °C ± 2 °C下10 min ± 1 min，自制备悬液起15 min内；达到80 °C的时间 ≤ 5 min；冷却至约20 °C。

完成检测需要多长时间？

整个程序共 8 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。

需要哪些设备？

培养箱37 °C ± 1 °C和厌氧培养系统（厌氧罐／厌氧箱）、恒温水浴44–47 °C以及80 °C ± 2 °C、冷冻箱−20 °C ± 2 °C和−70 °C ± 3 °C、冷藏箱5 °C ± 3 °C、无菌移液管10 ml、1 ml和0.1 ml，接种环、约90 mm（或140 mm）培养皿、在25 °C下校准准确度为 ± 0.1 pH的pH计。

该检测用于哪些场景？

即食和需复热的肉制品、多组分菜肴、餐饮配餐——食物中毒的指示菌；蛋和蛋制品、加工果蔬、婴儿配方食品和米糊（已验证的类别）；饲料和宠物食品、食品与饲料生产的环境样品、初级生产；经80 °C/10 min热处理后只计数芽孢（如评价热处理的效果）；区分对人致病与非致病的菌株（附录D的分子方法）。

需要采取哪些安全防护措施？

C. perfringens产生毒素并可引起食物中毒——须无菌操作，培养物须高压灭菌；80 °C水浴和44–47 °C的熔化琼脂——有烫伤风险；厌氧系统（产气袋、催化剂）——须按制造商的说明使用；培养基中的D-环丝氨酸（抗生素）——配制时避免吸入和接触皮肤。

哪家实验室可以开展此项检测？

该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 15213-2。

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