🦠 水中亚硫酸盐还原厌氧菌（梭菌）的芽孢——膜过滤法
三句话速览
把水样在(75 ± 5) °C下加热15 min以杀灭繁殖体，经0。该检测依据 PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986)；芽孢的选择：自达到温度起在(75 ± 5) °C下加热15 min；用带温度计的对照瓶控制。整个程序共 6 个步骤；主要用于：天然矿泉水、泉水和佐餐水在取水点和包装中的检验（按2011年卫生部长条例要求50 ml中为0）、饮用水、井水和泉水、轻度污染的地表水——体积100 ml、净水和氯化处理效果的评定（芽孢作为久远或周期性污染的指标）。
要点速览
- 标准: PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 芽孢的选择: 自达到温度起在(75 ± 5) °C下加热15 min；用带温度计的对照瓶控制
- 滤膜: 标称孔径0.2 µm的无菌滤膜；质量按ISO 7704
- 体积: 100 ml（饮用水、泉水、井水、矿泉水、海水、地表水）；< 10 ml须与10–100 ml无菌水混匀
概述
亚硫酸盐还原厌氧菌（梭菌）的芽孢在环境中广泛分布：存在于人和动物的粪便、废水和土壤中。与Escherichia coli和其他大肠菌群不同，芽孢在水中存活长久，因为它们比繁殖体对化学和物理因素更耐受——因而可指示久远的或周期性的污染；它们甚至可耐受净水中所用剂量的氯化处理，故对控制目的很有用。ISO 6461/2-1986（在波兰为PN-EN 26461-2:2001）规定了用膜过滤检出和定量测定梭菌芽孢的方法；它适用于所有种类的水，但大量颗粒会滞留在滤膜上的样品除外。梭菌定义为Bacillaceae（芽孢杆菌科）Clostridium（梭菌属）中还原亚硫酸盐、形成芽孢的厌氧微生物。在波兰，2011年3月31日卫生部长关于天然矿泉水、泉水和佐餐水的条例（Dz.U. 2011 nr 85 poz. 466［2011年《波兰法律公报》第85号第466项］）要求在取水点的50 ml水中排除亚硫酸盐还原梭菌（连同芽孢）的存在；实验室在瓶装水检验中采用该标准（培养基一览：按PN-EN 26461-2:2001的亚硫酸盐琼脂）。
方法原理
在规定体积的水中检出芽孢需要三个阶段：加热样品足够长的时间以破坏繁殖体，从而选择出芽孢；用孔径能截留芽孢的滤膜（0.2 µm）过滤；把滤膜置于选择性培养基（亚硫酸铁琼脂）上，在(37 ± 1) °C下培养(20 ± 4) h和(44 ± 4) h并计数黑色菌落。基础培养基为营养琼脂（肉浸膏、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂、水1000 ml；pH 7.6 ± 0.1，用1 mol/l NaOH调节；在(121 ± 1) °C下灭菌20 min；按每支18 ml分装到试管中，于4–5 °C保存并在2周后弃去）；临用前向18 ml熔化的培养基中加入1 ml亚硫酸钠溶液（10 g/100 ml，每2周新配）和5滴硫酸亚铁(II)溶液（8 g/100 ml）。替代品为胰蛋白胨亚硫酸盐琼脂（胰蛋白胨15 g、大豆胨5 g、酵母浸膏5 g、焦亚硫酸钠、柠檬酸铁(III)铵1 g）。培养基的酸度用pH计在25 °C下测定，滤膜的质量按ISO 7704控制，因为不同品牌和批次之间可能有差异。
应用领域
- 天然矿泉水、泉水和佐餐水在取水点和包装中的检验（按2011年卫生部长条例要求50 ml中为0）
- 饮用水、井水和泉水、轻度污染的地表水——体积100 ml
- 净水和氯化处理效果的评定（芽孢作为久远或周期性污染的指标）
- 废水和重度污染的水——与无菌水混匀后过滤较小的体积
- 水体监测中与Clostridium perfringens（产气荚膜梭菌）（PN-EN ISO 14189）并行的指标
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 芽孢的选择 | 自达到温度起在(75 ± 5) °C下加热15 min；用带温度计的对照瓶控制 |
| 滤膜 | 标称孔径0.2 µm的无菌滤膜；质量按ISO 7704 |
| 体积 | 100 ml（饮用水、泉水、井水、矿泉水、海水、地表水）；< 10 ml须与10–100 ml无菌水混匀 |
| 培养基 | 亚硫酸铁琼脂（18 ml培养基 + 1 ml 10 % Na₂SO₃ + 5滴8 % FeSO₄），pH 7.6 ± 0.1；也可用胰蛋白胨亚硫酸盐琼脂 |
| 培养 | (37 ± 1) °C厌氧；在(20 ± 4) h和(44 ± 4) h读数 |
| 结果 | 每样品体积中的黑色菌落数；报告44 h的读数（20 h的读数仅作近似） |
| 要求（矿泉水，波兰） | 50 ml中无亚硫酸盐还原梭菌（含芽孢） |
标准
- 标准编号
- PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986)
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe przetrwalników beztlenowców redukujących siarczyny (clostridia) — Część 2: Metoda filtracji membranowej
- 标准名称（英语）
- Water quality — Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia) — Part 2: Method by membrane filtration
分步操作程序
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采样与准备
按ISO 5667-2和ISO 8199采样；按ISO 5667-3保存。
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芽孢的选择
把样品在水浴中于(75 ± 5) °C下加热15 min，自达到该温度时起计；定期使用装有同体积水并带温度计的对照瓶来检查升温时间。
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过滤
按ISO 7704过滤适当的体积：饮用水、泉水、井水、矿泉水、海水和轻度污染的地表水为100 ml；重度污染的水和废水则较少（< 10 ml的体积须与10–100 ml无菌水混匀）。选择稀释度使菌落分布良好。
-
用培养基覆盖滤膜
用无菌镊子把滤膜过滤面朝下移到培养皿底部，不得有气泡；按住滤膜，小心倒入18 ml已冷却至约50 °C的完全培养基（含亚硫酸盐和硫酸亚铁）并静置凝固。
-
培养
在(37 ± 1) °C下厌氧（或在其他能保证厌氧的条件下）培养(20 ± 4) h和(44 ± 4) h；在厌氧罐或厌氧培养箱中可把滤膜过滤面朝上放在琼脂表面。
-
读数与报告
在(20 ± 4) h和(44 ± 4) h计数全部黑色菌落；按ISO 8199把结果表示为每样品体积中亚硫酸盐还原厌氧菌（梭菌）的数量——通常采用44 h的读数，20 h的读数仅作近似；说明偏离以及可能影响结果的情况。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 膜过滤装置 | 漏斗、底座、真空泵 | — |
| (75 ± 5) °C水浴配温度计 | 同体积的对照瓶用于检查升温时间 | — |
| 培养箱(37 ± 1) °C和厌氧系统 | 厌氧罐或厌氧培养箱（此时滤膜可过滤面朝上放在琼脂表面） | — |
| 高压灭菌器、蒸发器、pH计 | 培养基灭菌(121 ± 1) °C；pH在25 °C测定 | — |
| 160 × 16 mm试管、10 ml移液管（分度0.1 ml）、2 l烧瓶、1 l广口瓶、培养皿、无菌镊子 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 营养琼脂（肉浸膏、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂、水至1 l），pH 7.6 ± 0.1 | — | 基础培养基，按每份18 ml分装 |
| 亚硫酸钠Na₂SO₃——10 g溶于100 ml水（每2周新配） | — | 选择性－鉴别性成分（每18 ml培养基加1 ml） |
| 硫酸亚铁(II) FeSO₄——8 g结晶盐溶于100 ml水 | — | 指示剂——菌落周围生成黑色硫化铁（每18 ml加5滴） |
| 胰蛋白胨亚硫酸盐琼脂（胰蛋白胨15 g、大豆胨5 g、酵母浸膏5 g、焦亚硫酸钠、柠檬酸铁(III)铵1 g/l） | — | 替代培养基 |
| 氢氧化钠1 mol/l | — | 调节培养基的pH |
| 不含抑制性物质的蒸馏水或去离子水（ISO 3696） | — | 培养基以及小体积样品的稀释 |
职业健康与安全
- Clostridium属厌氧菌的培养物（其中可能包括C. perfringens）——在微生物实验室中操作，对废弃物高压灭菌
- 高温水浴和约50 °C的熔化琼脂——覆盖滤膜时须小心
- 带产气装置的厌氧罐——按制造商说明操作
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986) — 《Water quality — Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia) — Part 2: Method by membrane filtration》。
该方法的原理是什么？
在规定体积的水中检出芽孢需要三个阶段：加热样品足够长的时间以破坏繁殖体，从而选择出芽孢；用孔径能截留芽孢的滤膜（0.2 µm）过滤；把滤膜置于选择性培养基（亚硫酸铁琼脂）上，在(37 ± 1) °C下培养(20 ± 4) h和(44 ± 4) h并计数黑色菌落。
测量范围和准确度是多少？
芽孢的选择：自达到温度起在(75 ± 5) °C下加热15 min；用带温度计的对照瓶控制；滤膜：标称孔径0.2 µm的无菌滤膜；质量按ISO 7704；体积：100 ml（饮用水、泉水、井水、矿泉水、海水、地表水）；< 10 ml须与10–100 ml无菌水混匀；培养基：亚硫酸铁琼脂（18 ml培养基 + 1 ml 10 % Na₂SO₃ + 5滴8 % FeSO₄），pH 7.6 ± 0.1；也可用胰蛋白胨亚硫酸盐琼脂。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
膜过滤装置、(75 ± 5) °C水浴配温度计、培养箱(37 ± 1) °C和厌氧系统、高压灭菌器、蒸发器、pH计、160 × 16 mm试管、10 ml移液管（分度0.1 ml）、2 l烧瓶、1 l广口瓶、培养皿、无菌镊子。
该检测用于哪些场景？
天然矿泉水、泉水和佐餐水在取水点和包装中的检验（按2011年卫生部长条例要求50 ml中为0）；饮用水、井水和泉水、轻度污染的地表水——体积100 ml；净水和氯化处理效果的评定（芽孢作为久远或周期性污染的指标）；废水和重度污染的水——与无菌水混匀后过滤较小的体积；水体监测中与Clostridium perfringens（产气荚膜梭菌）（PN-EN ISO 14189）并行的指标。
需要采取哪些安全防护措施？
Clostridium属厌氧菌的培养物（其中可能包括C. perfringens）——在微生物实验室中操作，对废弃物高压灭菌；高温水浴和约50 °C的熔化琼脂——覆盖滤膜时须小心；带产气装置的厌氧罐——按制造商说明操作。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN 26461-2。