🌿 水中叶绿素 a
地表水经过滤和丙酮萃取后分光光度测定叶绿素 a。水体富营养化和水体营养状态的关键指标。
要点速览
- 标准: PN-ISO 10260:2002
- 类别: 理化
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 13 小时 8 分钟–1 天 1 小时 53 分钟
- 测量波长: 665 nm（叶绿素 a）、750 nm（背景校正）
- 测量范围: 0,5–500 µg/L（可调整过滤体积）
- 定量限（LOQ）: 0,5–1,0 µg/L
概述
叶绿素 a 是所有光合自养生物 — 藻类、蓝细菌和水生植物 — 中的主要光合色素。其在水中的浓度是广泛使用的浮游植物生物量和水体富营养化程度指标。水体营养状态分级在很大程度上基于叶绿素 a 浓度：贫营养水体（<2,5 µg/L）、中营养（2,5–8 µg/L）、富营养（8–25 µg/L）和超富营养（>25 µg/L）。
按 PN-ISO 10260 的分光光度法是将浮游植物富集于玻璃纤维滤膜（GF/C 或 GF/F）上，用丙酮（90%）提取色素，并在 665 nm（叶绿素 a 吸收极大）处测定吸光度，同时在 750 nm 处作浊度校正。用 HCl 酸化提取液可区分有活性的叶绿素 a 与其降解产物（脱镁叶绿素 a）。
水框架指令（2000/60/EC）要求将叶绿素 a 监测作为地表水状态生物学评价的组成部分。在波兰，该参数是湖泊和水库生态状态评定的必测项目（法律公报 2019 年第 2149 项）。
叶绿素 a 也可用荧光法（更灵敏，LOD 约 0,1 µg/L）或色谱法（HPLC — 分离各色素）测定。但分光光度法因简便、成本低仍是基准方法。
方法原理
用真空过滤将规定体积水样（0,5–2 L）中的浮游植物富集于玻璃纤维滤膜（GF/C，孔径 1,2 µm 或 GF/F，0,7 µm）上。将带残留物的滤膜在 90% 丙酮中匀浆，并在 4°C 避光提取 12–24 小时。提取液经离心（500 g，20 min）澄清。在 665 nm（叶绿素 a）和 750 nm（浊度校正）处测定吸光度。随后用 0,1 M HCl 酸化提取液（每 10 mL 提取液加 0,1 mL），90 秒后再次在 665 和 750 nm 处测定吸光度。酸化前后的吸光度差可用于计算有活性叶绿素 a 和脱镁叶绿素 a 的浓度。计算式：Chl a [µg/L] = 26,7 ×（A665₀ - A665a）× V_提取液 /（V_水样 × l），其中 l 为光程长度。
应用领域
- 湖泊和水库富营养化监测（WFD 2000/60/EC）
- 地表水营养状态分级（贫营养 → 超富营养）
- 水体生态状态评定 — 生物学要素（法律公报 2019 年第 2149 项）
- 藻类和蓝细菌水华监测（毒素风险）
- 地表水取水口水质控制
- 湖沼学和海洋学研究
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 测量波长 | 665 nm（叶绿素 a）、750 nm（背景校正） |
| 测量范围 | 0,5–500 µg/L（可调整过滤体积） |
| 定量限（LOQ） | 0,5–1,0 µg/L |
| 提取溶剂 | 90% 丙酮水溶液 |
| 提取时间 | 4°C 避光 12–24 小时 |
| 营养状态分级 | <2,5 µg/L 贫营养 | 2,5–8 中营养 | 8–25 富营养 | >25 超富营养 |
标准
- 标准编号
- PN-ISO 10260:2002
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Pomiar parametrów biochemicznych — Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia chlorofilu a
- 标准名称（英语）
- Water quality — Measurement of biochemical parameters — Spectrometric determination of the chlorophyll a concentration
分步操作程序
-
水样采集
在规定深度采取有代表性的水样（1–5 L）。4°C 避光保存。采样后 4 小时内过滤。
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过滤
将 GF/C 滤膜（47 mm）置于真空过滤装置上。在滤膜上撒少量 MgCO₃。在真空（<0,3 bar）下过滤量取的样品体积（0,5–2 L）。
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丙酮提取
将带残留物的滤膜转入离心管。加入 10 mL 90% 丙酮。用 Ultra-Turrax 匀浆滤膜（30 s）。密闭并用铝箔包裹。
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避光孵育
将离心管置于冰箱（4°C）中避光 12–24 小时。丙酮渗入细胞并萃取色素。
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提取液澄清
将提取液离心（500 g，20 min）或经 GF/F 滤膜过滤。将澄清提取液转入洁净小瓶。
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吸光度测定（酸化前）
以 90% 丙酮为空白，在 665 nm 和 750 nm 处测定吸光度。记录 A665₀ 和 A750₀。
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HCl 酸化
向装有 10 mL 提取液的比色皿中加入 0,1 mL 0,1 M HCl。轻轻颠倒混匀。恰好等待 90 秒。
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吸光度测定（酸化后）
在 665 nm 和 750 nm 处测定吸光度。记录 A665a 和 A750a。酸化使叶绿素转化为脱镁叶绿素。
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计算
Chl a [µg/L] = 26,7 × [(A665₀ - A750₀) - (A665a - A750a)] × V_提取液 [mL] /（V_水样 [L] × l [cm]）。脱镁叶绿素 a = 26,7 × [1,7 ×（A665a - A750a）-（A665₀ - A750₀）] × V_e /（V_p × l）。
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质量控制
丙酮中已知浓度的叶绿素 a 标准 — 回收率 90–110%。丙酮空白 A665 < 0,005。平行样：CV < 15%。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| UV-Vis 分光光度计 | Shimadzu UV-1900i、Hach DR 6000、Agilent Cary 60、Thermo Evolution 201 | 15 000–80 000 PLN |
| 真空过滤装置 | Sartorius、Millipore，47 mm 漏斗 + 抽滤瓶 + 隔膜泵 | 2 000–5 000 PLN |
| GF/C 玻璃纤维滤膜 | Whatman GF/C 47 mm（1,2 µm）或 GF/F（0,7 µm） | 1–3 PLN / 片 |
| 实验室离心机 | Eppendorf 5804R、Hettich Universal 320R，至少 500 g | 10 000–40 000 PLN |
| 组织匀浆机 | IKA T10 basic Ultra-Turrax、玻璃 Potter 匀浆器 | 3 000–8 000 PLN |
| 实验室冰箱（4°C） | Liebherr LKPv 6520、POL-EKO CHL 700 | 5 000–15 000 PLN |
| 1–5 cm 玻璃比色皿 | Hellma、Starna，光学硼硅玻璃 | 100–500 PLN / 只 |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 丙酮（C₃H₆O）90% | 67-64-1 | 分析纯，900 mL 丙酮 + 100 mL 去离子水，提取溶剂 |
| 盐酸（HCl）0,1 M | 7647-01-0 | 用于酸化提取液 — 区分叶绿素 a 与脱镁叶绿素 a |
| 碳酸镁（MgCO₃） | 546-93-0 | 过滤前加于滤膜 — 防止叶绿素降解 |
| 叶绿素 a 标准品 | 479-61-8 | 来自集胞藻或菠菜的纯叶绿素 a，用于校准，Sigma-Aldrich C6144 |
| 去离子水 | — | 配制 90% 丙酮和冲洗用 |
职业健康与安全
- 丙酮 — 易燃（闪点 -20°C），蒸气可形成爆炸性混合物，须在通风柜中操作！
- 盐酸 — 腐蚀性，蒸气有刺激性，须在通风处使用
- 水样 — 可能含蓝藻毒素（微囊藻毒素），须戴手套
- 必须佩戴护目镜、实验服和丁腈手套
- 丙酮废液须收集于易燃有机废物容器中
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-ISO 10260:2002 — 《Water quality — Measurement of biochemical parameters — Spectrometric determination of the chlorophyll a concentration》。
该方法的原理是什么？
用真空过滤将规定体积水样（0,5–2 L）中的浮游植物富集于玻璃纤维滤膜（GF/C，孔径 1,2 µm 或 GF/F，0,7 µm）上。将带残留物的滤膜在 90% 丙酮中匀浆，并在 4°C 避光提取 12–24 小时。
测量范围和准确度是多少？
测量波长：665 nm（叶绿素 a）、750 nm（背景校正）；测量范围：0,5–500 µg/L（可调整过滤体积）；定量限（LOQ）：0,5–1,0 µg/L；提取溶剂：90% 丙酮水溶液。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 13 小时 8 分钟–1 天 1 小时 53 分钟。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
UV-Vis 分光光度计、真空过滤装置、GF/C 玻璃纤维滤膜、实验室离心机、组织匀浆机、实验室冰箱（4°C）、1–5 cm 玻璃比色皿。核心仪器的参考价格（UV-Vis 分光光度计）：15 000–80 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
湖泊和水库富营养化监测（WFD 2000/60/EC）；地表水营养状态分级（贫营养 → 超富营养）；水体生态状态评定 — 生物学要素（法律公报 2019 年第 2149 项）；藻类和蓝细菌水华监测（毒素风险）；地表水取水口水质控制；湖沼学和海洋学研究。
需要采取哪些安全防护措施？
丙酮 — 易燃（闪点 -20°C），蒸气可形成爆炸性混合物，须在通风柜中操作！；盐酸 — 腐蚀性，蒸气有刺激性，须在通风处使用；水样 — 可能含蓝藻毒素（微囊藻毒素），须戴手套；必须佩戴护目镜、实验服和丁腈手套；丙酮废液须收集于易燃有机废物容器中。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-ISO 10260。