🧴 防腐挑战试验 — 防腐效能评价
化妆品防腐效能试验（challenge test / PET）。按 ISO 11930 接种试验菌株并在 28 天内监测微生物数量下降。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 11930:2019/A1:2022
- 类别: 制药与化妆品
- 操作步骤数: 11
- 各步骤合计时间: 31 天 6 小时 45 分钟–33 天 8 小时 45 分钟
- 试验菌株: 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、大肠埃希氏菌 ATCC 8739、铜绿假单胞菌 ATCC 9027、白色念珠菌 ATCC 10231、巴西曲霉 ATCC 16404
- 接种浓度: 10⁵–10⁶ CFU/g 产品
- 培养温度: 20–25°C
概述
防腐挑战试验（激发试验，Preservation Efficacy Test — PET）是评价化妆品在生产、储存和使用期间抵抗二次微生物污染能力的关键微生物学试验。PN-EN ISO 11930 标准规定了评价化妆品抗微生物防护的基准方法。
试验是向化妆品样品中受控地引入（接种）已知数量的试验微生物，随后在 28 天内于严格规定的时间点监测这些微生物数量的变化。计算每个菌株、每个时间点的对数下降值，并将结果与标准验收判据比较。
按（EC）1223/2009 号法规，该试验是化妆品安全评估的必需内容。防腐挑战试验是化妆品产品资料档案（PIF — 产品信息文件）的基本组成部分，并为产品安全负责人（安全评估员）所要求。
标准规定了两种验收档次：A 档（首选 — 防护强）和 B 档（可接受 — 防护最低限度）。挑战试验结果确认产品的防腐体系（防腐剂、pH、水分活度、配方）足以在使用条件下抵抗现实的污染。完整试验（5 个菌株 × 平行样 × 4 个时间点）所需最少样品量为 250 g。
方法原理
将化妆品样品分别接种五株试验菌：金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、大肠埃希氏菌 ATCC 8739、铜绿假单胞菌 ATCC 9027、白色念珠菌 ATCC 10231 和巴西曲霉 ATCC 16404。每株菌的接种浓度约为 10⁵–10⁶ CFU/g 产品（接种量不得使产品组成改变超过 1%）。样品在 20–25°C 下培养。在第 7、14 和 28 天（细菌和酵母）以及第 14 和 28 天（霉菌）取样，中和防腐体系（用稀释法或化学中和剂），并用平板法测定存活微生物数量。计算对数下降值：log R = log N₀ − log Nₜ，其中 N₀ 为接种后的 CFU 数，Nₜ 为第 t 天的 CFU 数。结果与 A 档或 B 档判据比较。
应用领域
- 新化妆品配方防腐体系有效性评价
- 配方变更（更换防腐剂、调整 pH）后的防腐效果验证
- 注册用产品微生物稳定性检验
- 按 1223/2009 号法规编制安全评估文件（PIF）
- 防腐剂浓度优化（在保持有效的前提下降到最低）
- 防腐体系对比试验（传统体系与"无防腐剂"体系）
- "天然"/"不含对羟基苯甲酸酯"宣称产品的防护确认
- 生产工艺（热灌装、无菌灌装）确认
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 试验菌株 | 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、大肠埃希氏菌 ATCC 8739、铜绿假单胞菌 ATCC 9027、白色念珠菌 ATCC 10231、巴西曲霉 ATCC 16404 |
| 接种浓度 | 10⁵–10⁶ CFU/g 产品 |
| 培养温度 | 20–25°C |
| 测定时间点（细菌/酵母） | 第 7、14、28 天 |
| 测定时间点（霉菌） | 第 14、28 天 |
| A 档（首选）— 细菌 | 第 7 天下降 ≥3 log，第 14 天 ≥3 log，第 28 天无生长 |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 11930:2019/A1:2022
- 标准名称（波兰语）
- Kosmetyki — Mikrobiologia — Ocena ochrony przeciwdrobnoustrojowej produktu kosmetycznego
- 标准名称（英语）
- Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product
分步操作程序
-
试验菌株制备
将冻干菌株在相应培养基上活化（细菌用 TSA，真菌用 SDA）。传代 2–3 次。制备浓度 10⁷–10⁸ CFU/mL 的菌悬液。
-
接种物标准化
将菌悬液浓度调至 McFarland 0,5（约 10⁸ CFU/mL）或用比浊仪测定。稀释至 10⁶–10⁷ CFU/mL。
-
产品样品接种
将 20–30 g 产品称入无菌容器（每个菌株单独一份）。加入体积 <样品质量 1% 的接种物。充分混匀。使浓度达到 10⁵–10⁶ CFU/g。
-
初始浓度确认（T₀）
接种后立即取 1 g 样品。用中和剂稀释。接种 TSA/SDA。培养后计数菌落 — 确认 N₀。
-
样品培养
将接种后的样品在 20–25°C、避光条件下保存 28 天。非必要不得打开。
-
第 7 天取样
取 1 g 样品（细菌 + 酵母）。用中和剂（Dey-Engley 肉汤）稀释。做稀释系列（10⁻¹ 至 10⁻⁵）。接种 TSA/SDA。培养。
-
第 14 天取样
对全部五个菌株（细菌、酵母和霉菌）重复第 7 天的程序。接种、培养、读数。
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第 28 天取样
最后一个测定点。取样、稀释、接种、培养。对全部菌株读数并计数菌落。
-
对数下降值计算
对每个菌株和每个时间点计算：log R = log₁₀(N₀) − log₁₀(Nₜ)。将结果与 ISO 11930 的 A 档和 B 档判据比较。
-
结果评定
A 档（首选）：细菌至第 7 天下降 ≥3 log、第 28 天无生长；酵母第 7 天 ≥1 log、第 28 天无生长；霉菌第 14、28 天无生长。B 档（可接受）：判据较宽。
-
报告与记录
编制报告：产品标识、试验菌株、结果（CFU/g 和 log R 表）、A/B 档评定、防腐效能结论。作为 PIF 组成部分归档。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| II 级生物安全柜 | Thermo Fisher MSC-Advantage、Esco Labculture、FASTER BH-EN | 25 000–60 000 PLN |
| 20–25°C 培养箱（带制冷） | Memmert IPP110、Binder KB240、POL-EKO ST 500 | 10 000–25 000 PLN |
| 30–35°C 培养箱 | Memmert IN110、Binder BD115 | 8 000–20 000 PLN |
| 高压灭菌器 | Tuttnauer 3870ELV、Systec VX-75 | 20 000–60 000 PLN |
| 45–50°C 水浴 | Memmert WNB 22、GFL 1012，用于培养基保温 | 3 000–8 000 PLN |
| 涡旋混匀器 | IKA Vortex 3、Heidolph Reax top | 1 500–4 000 PLN |
| 菌落计数器 | Interscience Scan 300、IUL Flash & Go | 5 000–20 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 | — | 冻干标准菌株，-20°C / -80°C 保存，自标准株起最多传 5 代 |
| 大肠埃希氏菌 ATCC 8739 | — | 冻干标准菌株，冻存磁珠 -80°C 保存 |
| 铜绿假单胞菌 ATCC 9027 | — | 标准菌株，冻存磁珠 -80°C 保存 |
| 白色念珠菌 ATCC 10231 | — | 酵母 — 标准菌株，SDA 培养，30–35°C |
| 巴西曲霉 ATCC 16404 | — | 霉菌 — 标准菌株，PDA 培养，20–25°C，7–14 天后收集孢子 |
| 胰酪大豆琼脂（TSA） | 91079-40-2 | 细菌培养和 TAMC 测定用，500 g |
| 沙保罗葡萄糖琼脂（SDA） | — | 酵母和霉菌培养用，含氯霉素 50 mg/L |
| 中和液（Dey-Engley 肉汤） | — | 广谱防腐剂（对羟基苯甲酸酯、甲醛、季铵盐、异噻唑啉酮）中和肉汤 |
职业健康与安全
- 操作致病微生物（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌）— 必须在 BSL-2 生物安全柜中进行
- 必须佩戴丁腈手套、护目镜和实验服
- 巴西曲霉 — 孢子有致敏性，避免吸入，须在生物安全柜中操作
- 所有生物废物须高压灭菌后再废弃（121°C，15 min，1 atm）
- 作业前后用 70% 酒精对工位消毒
- 菌株冻存磁珠 — 于 -80°C 冰箱保存，保持传代登记
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 11930:2019/A1:2022 — 《Cosmetics — Microbiology — Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product》。
该方法的原理是什么？
将化妆品样品分别接种五株试验菌：金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、大肠埃希氏菌 ATCC 8739、铜绿假单胞菌 ATCC 9027、白色念珠菌 ATCC 10231 和巴西曲霉 ATCC 16404。每株菌的接种浓度约为 10⁵–10⁶ CFU/g 产品（接种量不得使产品组成改变超过 1%）。
测量范围和准确度是多少？
试验菌株：金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、大肠埃希氏菌 ATCC 8739、铜绿假单胞菌 ATCC 9027、白色念珠菌 ATCC 10231、巴西曲霉 ATCC 16404；接种浓度：10⁵–10⁶ CFU/g 产品；培养温度：20–25°C；测定时间点（细菌/酵母）：第 7、14、28 天。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 31 天 6 小时 45 分钟–33 天 8 小时 45 分钟。整个程序共 11 个步骤。
需要哪些设备？
II 级生物安全柜、20–25°C 培养箱（带制冷）、30–35°C 培养箱、高压灭菌器、45–50°C 水浴、涡旋混匀器、菌落计数器。核心仪器的参考价格（II 级生物安全柜）：25 000–60 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
新化妆品配方防腐体系有效性评价；配方变更（更换防腐剂、调整 pH）后的防腐效果验证；注册用产品微生物稳定性检验；按 1223/2009 号法规编制安全评估文件（PIF）；防腐剂浓度优化（在保持有效的前提下降到最低）；防腐体系对比试验（传统体系与"无防腐剂"体系）；"天然"/"不含对羟基苯甲酸酯"宣称产品的防护确认；生产工艺（热灌装、无菌灌装）确认。
需要采取哪些安全防护措施？
操作致病微生物（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌）— 必须在 BSL-2 生物安全柜中进行；必须佩戴丁腈手套、护目镜和实验服；巴西曲霉 — 孢子有致敏性，避免吸入，须在生物安全柜中操作；所有生物废物须高压灭菌后再废弃（121°C，15 min，1 atm）；作业前后用 70% 酒精对工位消毒；菌株冻存磁珠 — 于 -80°C 冰箱保存，保持传代登记。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 11930。