🦠 食品中的Campylobacter spp.（弯曲菌属）——微需氧气氛中mCCDA琼脂上的计数法，41.5 °C
三句话速览
把0.1 ml初始悬液（数量低时为1 ml接种于大平板）和稀释液表面涂布接种于改良炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂（mCCDA），在41。该检测依据 PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023)；培养基：改良炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂（mCCDA）；组成和性能试验——附录B。整个程序共 6 个步骤；主要用于：冷却后肉鸡胴体（颈皮）的过程卫生标准——1000 CFU/g，参比方法EN ISO 10272-2（第2073/2005号条例第2.1.9项）、禽肉和其他生鲜肉、生乳、初级生产的样品——禽场中的粪便、尘土、拭子（生物安全）。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 培养基: 改良炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂（mCCDA）；组成和性能试验——附录B
- 培养: 41.5 °C ± 1 °C，44 h ± 4 h，微需氧气氛（O₂ 5 ± 2 %、CO₂ 10 ± 3 %，可选H₂ ≤ 10 %，其余为N₂）
- 接种物: 90 mm平板0.1 ml；数量低时140 mm平板1.0 ml或3 × 90 mm（双份）
概述
ISO 10272-2:2017规定了测定供人食用和动物饲用产品、食品和饲料生产与流通环节的环境样品以及初级生产样品（动物粪便、尘土、拭子）中Campylobacter spp.数量的水平法。第一版取代了ISO/TS 10272-2:2006；其变化（被认为是细微的）包括：增加了初级生产样品、稀释液单份接种而非双份接种（按ISO 7218）、以25 °C下的需氧生长试验取代25 °C微需氧生长和41.5 °C需氧生长试验、增加了培养基的性能试验（附录B）和方法特性（附录C）。修改单Amd 1:2023引入了确证和鉴定耐热Campylobacter的分子方法，以及培养基性能试验的变更。Campylobacter定义为在41.5 °C微需氧气氛中于固体选择性培养基上形成特征性菌落，并具有特征性形态、动力以及生化和生长特性的微生物；该标准涉及与健康相关的耐热菌种——最常见的是C. jejuni和C. coli，也包括C. lari、C. upsaliensis。第2073/2005号条例（欧共体）（过程卫生标准2.1.9）指明EN ISO 10272-2为冷却后肉鸡胴体中Campylobacter spp.的参比方法：限值1000 CFU/g，n = 50，c = 10，自2025年1月1日起（此前为20，随后为15）；不符合时——改善屠宰卫生和养殖场的生物安全。检验只可在具备相应设备的实验室中在微生物学专业人员监督下进行。
方法原理
测定需要三个连续的阶段（附录A）：按ISO 6887制备十倍稀释液（单份系列）；把规定量的液体样品或初始悬液及其稀释液接种于固体选择性培养基——改良炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂（mCCDA），在41.5 °C的微需氧气氛中培养，44 h后判读并记录可疑菌落数；确证——在显微镜下检查形态和动力，转接到非选择性血琼脂上，做氧化酶试验并检查25 °C下的需氧生长（可选用生化和／或分子方法鉴定菌种）。每块mCCDA平板接种0.1 ml悬液，数量低时——1.0 ml接种于140 mm平板或三块90 mm平板（双份：两块大平板或六块普通平板）；若只使用初始悬液，则制备双份。接种物用无菌涂布棒迅速涂开；平板的干燥对可计数性至关重要，每个实验室采用自己标准化的方式。微需氧气氛：5 % ± 2 % O₂、10 % ± 3 % CO₂，可选 ≤ 10 % H₂，其余为氮气——在配有产气装置的气密罐中，或通过向罐／培养箱中充入混合气体实现。mCCDA上的典型菌落为灰白色、常带金属光泽、扁平而湿润，有蔓延的倾向（琼脂较干时较少）；菌落的识别在很大程度上取决于经验。氧化酶试验不得使用镍铬接种环。Campylobacter对冷冻极为敏感，而在低温下存活最好——样品不得冷冻，应保存于3 °C，尽快检验并防止干燥。
应用领域
- 冷却后肉鸡胴体（颈皮）的过程卫生标准——1000 CFU/g，参比方法EN ISO 10272-2（第2073/2005号条例第2.1.9项）
- 禽肉和其他生鲜肉、生乳
- 初级生产的样品——禽场中的粪便、尘土、拭子（生物安全）
- 屠宰场和分割厂的环境样品
- 风险评估和干预措施（冷却、胴体冲洗）效果评价中的定量检验
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养基 | 改良炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂（mCCDA）；组成和性能试验——附录B |
| 培养 | 41.5 °C ± 1 °C，44 h ± 4 h，微需氧气氛（O₂ 5 ± 2 %、CO₂ 10 ± 3 %，可选H₂ ≤ 10 %，其余为N₂） |
| 接种物 | 90 mm平板0.1 ml；数量低时140 mm平板1.0 ml或3 × 90 mm（双份） |
| 确证 | 形态与动力（显微镜，最好用相差）、转接到血琼脂、氧化酶 +、25 °C下无需氧生长；可选菌种鉴定（生化、PCR——Amd 1:2023） |
| 法定标准 | 肉鸡胴体：1000 CFU/g，n = 50，c = 10（自2025年1月1日起） |
| 样品保存 | 不得冷冻，3 °C ± 2 °C，尽快分析，防止干燥 |
| 结果 | CFU/g、CFU/ml、CFU/cm²或每件采样器具 |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter spp. — Część 2: Metoda liczenia kolonii
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique
分步操作程序
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样品
按ISO/TS 17728（食品）、ISO 13307（初级生产）、ISO 17604（胴体）或ISO 18593（表面）采样；不得冷冻，保存于3 °C，尽快检验。按ISO 6887制备初始悬液和单份十倍稀释系列。
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接种
把0.1 ml初始悬液（或液体样品）及后续稀释液移至mCCDA平板；数量低时——1.0 ml接种于140 mm平板或三块90 mm平板，作双份；只用初始悬液时制备双份。用无菌涂布棒迅速涂开，不要触及边缘；平板按标准化方式干燥。
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微需氧培养
把平板放入配有产气装置的罐中（严格按制造商说明）或放入充有混合气体的培养箱，在41.5 °C下培养44 h ± 4 h。
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可疑菌落的计数
记录典型／可疑菌落数：灰白色、常带金属光泽、扁平而湿润、有蔓延；也可能出现其他形态。
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确证
把选取的菌落在显微镜下观察（形态、动力），转接到血琼脂上，做氧化酶试验（用非Ni-Cr接种环）并检查25 °C下的需氧生长（Campylobacter不生长）；可选用生化或分子方法鉴定菌种。
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结果
由每块平板上经确证的典型菌落数计算Campylobacter数，以CFU/g、ml、cm²或每件采样器具表示；与肉鸡胴体1000 CFU/g的标准比较。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱25 °C ± 1 °C、37 °C ± 1 °C和41.5 °C ± 1 °C | 25 °C下的需氧生长——确证试验 | — |
| 配产气装置的气密罐或充有混合气体的培养箱 | 微需氧气氛5 % O₂、10 % CO₂ | — |
| 相差显微镜 | Campylobacter的形态和动力 | — |
| 无菌培养皿90 mm，可选140 mm（最好带通气） | — | |
| 10 µl和1 µl接种环（氧化酶不用Ni-Cr）、接种针、水浴37 °C ± 1 °C、冰箱3 °C ± 2 °C和5 °C ± 3 °C | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| mCCDA琼脂（改良炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂）——基础培养基加抗生素添加剂（附录B） | — | 选择性菌落计数 |
| 血琼脂（非选择性） | — | 供确证用的纯培养物 |
| 氧化酶试验试剂 | — | 确证（氧化酶阳性） |
| 按ISO 6887的稀释液 | — | 初始悬液和单份十倍稀释系列 |
| 对照菌株以及生化／分子鉴定试剂盒（可选） | — | 培养基的性能试验、菌种鉴定 |
职业健康与安全
- Campylobacter是人的致病菌——检验只可在具备相应设备的实验室中在微生物学专业人员监督下进行，培养后的材料须妥善销毁
- 产气装置和含氢（≤ 10 %）的混合气体——按制造商说明操作，使用气密罐
- 添加剂中的头孢哌酮和其他抗生素——避免扬尘和接触
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023) — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique》。
该方法的原理是什么？
测定需要三个连续的阶段（附录A）：按ISO 6887制备十倍稀释液（单份系列）；把规定量的液体样品或初始悬液及其稀释液接种于固体选择性培养基——改良炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂（mCCDA），在41.5 °C的微需氧气氛中培养，44 h后判读并记录可疑菌落数；确证——在显微镜下检查形态和动力，转接到非选择性血琼脂上，做氧化酶试验并检查25 °C下的需氧生长（可选用生化和／或分子方法鉴定菌种）。
测量范围和准确度是多少？
培养基：改良炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂（mCCDA）；组成和性能试验——附录B；培养：41.5 °C ± 1 °C，44 h ± 4 h，微需氧气氛（O₂ 5 ± 2 %、CO₂ 10 ± 3 %，可选H₂ ≤ 10 %，其余为N₂）；接种物：90 mm平板0.1 ml；数量低时140 mm平板1.0 ml或3 × 90 mm（双份）；确证：形态与动力（显微镜，最好用相差）、转接到血琼脂、氧化酶 +、25 °C下无需氧生长；可选菌种鉴定（生化、PCR——Amd 1:2023）。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱25 °C ± 1 °C、37 °C ± 1 °C和41.5 °C ± 1 °C、配产气装置的气密罐或充有混合气体的培养箱、相差显微镜、无菌培养皿90 mm，可选140 mm（最好带通气）、10 µl和1 µl接种环（氧化酶不用Ni-Cr）、接种针、水浴37 °C ± 1 °C、冰箱3 °C ± 2 °C和5 °C ± 3 °C。
该检测用于哪些场景？
冷却后肉鸡胴体（颈皮）的过程卫生标准——1000 CFU/g，参比方法EN ISO 10272-2（第2073/2005号条例第2.1.9项）；禽肉和其他生鲜肉、生乳；初级生产的样品——禽场中的粪便、尘土、拭子（生物安全）；屠宰场和分割厂的环境样品；风险评估和干预措施（冷却、胴体冲洗）效果评价中的定量检验。
需要采取哪些安全防护措施？
Campylobacter是人的致病菌——检验只可在具备相应设备的实验室中在微生物学专业人员监督下进行，培养后的材料须妥善销毁；产气装置和含氢（≤ 10 %）的混合气体——按制造商说明操作，使用气密罐；添加剂中的头孢哌酮和其他抗生素——避免扬尘和接触。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 10272-2。