🔴 食品中弯曲菌
通过 Bolton 或 Preston 肉汤选择性增菌、mCCDA 琼脂分离及生化/分子确证，检测食品和饲料中的弯曲菌属。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 10272-1:2017
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 8
- 各步骤合计时间: 5 天 20 小时 35 分钟–7 天 22 小时 35 分钟
- 增菌温度: 37°C（4–6 h）→ 41,5°C（44 h）— 程序 A / 41,5°C（24 h）— 程序 B
- 气体环境: 微需氧：5% O₂、10% CO₂、85% N₂
- 增菌肉汤: Bolton 肉汤（程序 A）或 Preston 肉汤（程序 B）
概述
弯曲菌（Campylobacter）是欧盟最常见的细菌性胃肠炎（弯曲菌病）病因——每年登记病例超过 20 万例。主要致病种为空肠弯曲菌（约占 90%）和结肠弯曲菌（约占 10%）。感染源多为禽肉（尤其是鸡肉）、未经巴氏杀菌的乳和受污染的水。感染剂量极低——仅 500–800 个细胞即可致病。
PN-EN ISO 10272-1 标准描述了检测食品、饲料和环境样品中嗜热弯曲菌的水平法。方法包含三种适用于不同样品类型的检测程序：程序 A（Bolton 肉汤）— 适用于弯曲菌数量少且伴随菌群少的样品（冷冻食品、熟食）；程序 B（Preston 肉汤）— 适用于弯曲菌数量少但伴随菌群多的样品（生肉、生乳）；程序 C — 适用于弯曲菌数量多的样品，直接划线接种。
弯曲菌为微需氧菌——需要低氧气含量的气体环境（5% O₂、10% CO₂、85% N₂）和较高的培养温度（41,5°C）。它们营养要求苛刻，对氧气、干燥和低 pH 敏感，因此培养技术难度较大。
按（EC）2073/2005 号法规，肉鸡胴体必须进行弯曲菌检验。过程卫生标准为冷却后胴体 1000 CFU/g。这是食品安全监测计划中的优先病原菌。
方法原理
方法是在微需氧条件下用 Bolton 肉汤（37°C/4–6 h，随后 41,5°C/44 h）或 Preston 肉汤（41,5°C/24 h）对弯曲菌进行选择性增菌。肉汤中的抗生素（头孢哌酮、甲氧苄啶、万古霉素、放线菌酮）抑制伴随菌群。增菌后将样品划线接种于选择性固体培养基——mCCDA（改良碳源头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂）及第二种选择性培养基。mCCDA 中的活性炭吸附有毒代谢产物。弯曲菌菌落呈灰色、扁平、湿润、有金属光泽并有蔓延倾向。确证包括生化试验（氧化酶 +、过氧化氢酶 +、25°C 不生长）或 PCR。
应用领域
- 禽肉控制 — 肉鸡胴体（（EC）2073/2005 号法规）
- 生乳和未经巴氏杀菌乳制品检验
- 禽类屠宰厂生产线监测
- 饮用水和食品用水控制
- 即食（RTE）食品检验
- 弯曲菌病暴发的流行病学调查
- 禽类沙门氏菌/弯曲菌控制计划监测
- 肉类加工厂环境样品检验
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 增菌温度 | 37°C（4–6 h）→ 41,5°C（44 h）— 程序 A / 41,5°C（24 h）— 程序 B |
| 气体环境 | 微需氧：5% O₂、10% CO₂、85% N₂ |
| 增菌肉汤 | Bolton 肉汤（程序 A）或 Preston 肉汤（程序 B） |
| 分离培养基 | mCCDA（改良碳源头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂） |
| 菌落特征 | 灰色、扁平、湿润、有金属光泽、蔓延生长 |
| 确证 | 氧化酶 +、过氧化氢酶 +、形态（螺旋状）、25°C 不生长或 PCR |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 10272-1:2017
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Campylobacter spp. — Część 1: Metoda wykrywania
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 1: Detection method
分步操作程序
-
样品制备
称取 25 g（或 10 g）样品于均质袋中。加入 225 mL（或 90 mL）含抗生素补充剂和 5% 溶血马血的 Bolton 肉汤。
-
增菌 — 第一阶段（程序 A）
均质后在微需氧条件下培养：先于 37 ± 1°C 培养 4–6 h（复苏阶段），随后升温至 41,5 ± 1°C。
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增菌 — 第二阶段
在微需氧条件下于 41,5 ± 1°C 继续培养 44 ± 4 h（自起始计共 48 h）。
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mCCDA 分离
从增菌液划线接种至 mCCDA 平板及第二种选择性培养基。在微需氧条件下于 41,5 ± 1°C 培养 44 ± 4 h。
-
菌落读取
寻找弯曲菌典型菌落 — 灰色、扁平、湿润、有金属光泽并有蔓延倾向。也可能为针尖状、圆形、有光泽的菌落。
-
非选择性琼脂传代
从每个平板挑取至少 1 个典型菌落。传代至含 5% 羊血的哥伦比亚血琼脂。在微需氧条件下于 41,5°C 培养 24–48 h。
-
确证试验
进行：氧化酶试验（+）、过氧化氢酶试验（+）、显微镜制片（螺旋状）、25°C 生长试验（不生长）以及 41,5°C 需氧条件生长试验（不生长）。或采用 PCR 法确证。
-
判读与报告
报告结果为："在 X g 样品中检出/未检出弯曲菌属"。若进行了种的鉴定 — 注明：空肠弯曲菌或结肠弯曲菌。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 微需氧培养箱 | Binder CB 60/160 带气体控制，或厌氧罐 + 产气袋 | 15 000–50 000 PLN |
| 微需氧气体产生袋 | Oxoid CampyGen、bioMérieux GENbag microaer、Anaerocult C | 200–500 PLN / 10 个 |
| 厌氧罐 | Oxoid AnaeroJar 2,5 L、Merck Anaerocult | 500–1 500 PLN |
| II 级生物安全柜 | Thermo Scientific MSC-Advantage、ESCO Airstream AC2 | 25 000–60 000 PLN |
| 拍击式均质器 | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| 光学显微镜 | Olympus CX23、Zeiss Primo Star、Nikon Eclipse Si | 5 000–20 000 PLN |
| 实验室高压灭菌器 | Tuttnauer 2540M、Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| Bolton 肉汤 | — | 选择性增菌肉汤：肉蛋白胨、乳糖、丙酮酸钠、α-酮戊二酸、焦亚硫酸钠、碳酸钠；500 g 装 + 抗生素补充剂 |
| Bolton 补充剂（抗生素） | 62893-20-3 | 头孢哌酮、甲氧苄啶、万古霉素、放线菌酮；10 瓶装 |
| mCCDA 琼脂（改良碳源头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂） | 302-95-4 | 活性炭、脱氧胆酸钠、硫酸亚铁、丙酮酸钠、琼脂；500 g 装 |
| mCCDA 补充剂（头孢哌酮 + 两性霉素 B） | 62893-20-3 | 选择性抗生素，10 瓶装 |
| 溶血马血（5%） | — | Bolton 肉汤添加物 — 生长因子，中和抑制物；100 mL 装 |
| 氧化酶试剂（Kovács） | — | 用于确证试验 — 弯曲菌氧化酶阳性；试纸条或滴剂 |
| 缓冲蛋白胨水（BPW） | — | 用于制备初始悬液，500 g 装 |
职业健康与安全
- 弯曲菌 — BSL-2 病原菌，感染剂量极低（500 个细胞），须使用全套个人防护装备
- 仅可在 II 级生物安全柜中操作 — 打开厌氧罐时须格外小心
- 微需氧气体环境 — 产气袋可能造成局部氧含量下降，房间须通风
- 使用过的材料须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃
- 补充剂中的抗生素 — 避免皮肤接触，佩戴手套
- 用 70% 乙醇或 0,5% 次氯酸钠对台面消毒
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 10272-1:2017 — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 1: Detection method》。
该方法的原理是什么？
方法是在微需氧条件下用 Bolton 肉汤（37°C/4–6 h，随后 41,5°C/44 h）或 Preston 肉汤（41,5°C/24 h）对弯曲菌进行选择性增菌。肉汤中的抗生素（头孢哌酮、甲氧苄啶、万古霉素、放线菌酮）抑制伴随菌群。
测量范围和准确度是多少？
增菌温度：37°C（4–6 h）→ 41,5°C（44 h）— 程序 A / 41,5°C（24 h）— 程序 B；气体环境：微需氧：5% O₂、10% CO₂、85% N₂；增菌肉汤：Bolton 肉汤（程序 A）或 Preston 肉汤（程序 B）；分离培养基：mCCDA（改良碳源头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 5 天 20 小时 35 分钟–7 天 22 小时 35 分钟。整个程序共 8 个步骤。
需要哪些设备？
微需氧培养箱、微需氧气体产生袋、厌氧罐、II 级生物安全柜、拍击式均质器、光学显微镜、实验室高压灭菌器。核心仪器的参考价格（微需氧培养箱）：15 000–50 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
禽肉控制 — 肉鸡胴体（（EC）2073/2005 号法规）；生乳和未经巴氏杀菌乳制品检验；禽类屠宰厂生产线监测；饮用水和食品用水控制；即食（RTE）食品检验；弯曲菌病暴发的流行病学调查；禽类沙门氏菌/弯曲菌控制计划监测；肉类加工厂环境样品检验。
需要采取哪些安全防护措施？
弯曲菌 — BSL-2 病原菌，感染剂量极低（500 个细胞），须使用全套个人防护装备；仅可在 II 级生物安全柜中操作 — 打开厌氧罐时须格外小心；微需氧气体环境 — 产气袋可能造成局部氧含量下降，房间须通风；使用过的材料须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃；补充剂中的抗生素 — 避免皮肤接触，佩戴手套；用 70% 乙醇或 0,5% 次氯酸钠对台面消毒。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 10272-1。