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🎨 食品中合成着色剂（HPLC）

食品化学 PN-EN 12878

用配 UV-Vis/DAD 检测的 HPLC 鉴定并定量测定食品中的合成着色剂（柠檬黄、日落黄、偶氮玉红、诱惑红等）。

要点速览

  • 标准: PN-EN 12878:2014 (oraz metody wewnętrzne oparte na HPLC-DAD)
  • 类别: 食品化学
  • 操作步骤数: 10
  • 各步骤合计时间: 1 小时 45 分钟
  • 测定范围: 0,5–500 mg/kg（视着色剂和基质而定）
  • 检出限（LOD）: 0,1–0,5 mg/kg
  • 定量限（LOQ）: 0,5–1,0 mg/kg

概述

合成食品着色剂（E100–E199）因潜在健康风险 — 过敏反应、儿童多动（即所谓"南安普顿六种"）以及部分偶氮染料可能的致癌性 — 属于受控最频繁的食品添加剂之一。（EC）1333/2008 号法规规定了允许使用的着色剂及其在各食品类别中的最大用量。

配 UV-Vis（DAD — 二极管阵列检测器）检测的 HPLC 法是一次分析中同时鉴定并定量测定多种合成着色剂的基准分析技术。在 C18 柱上以反相色谱（RP-HPLC）梯度洗脱，可在约 20–30 分钟内分离并定量全部允许使用的合成着色剂。

最常测定的着色剂有：柠檬黄（E102）、喹啉黄（E104）、日落黄（E110）、偶氮玉红（E122）、丽春红 4R（E124）、诱惑红（E129）、亮蓝 FCF（E133）、靛蓝（E132）和绿色 S（E142）。方法要求先从食品基质中提取着色剂、用 SPE 小柱净化，再进行色谱分析。

开展此类检验的经认可实验室参加 FAPAS 和 LGC 组织的能力验证（PT）计划，以保证结果在国际水平上的可靠性。

方法原理

用水/甲醇/氨水混合液从食品样品中提取合成着色剂，经 SPE 小柱（聚酰胺或 C18）净化后，在 C18 柱上以梯度洗脱（流动相：pH 7 乙酸铵缓冲液 / 乙腈）进行液相色谱分离。用 DAD（二极管阵列检测器）在多个波长（427 nm、482 nm、520 nm、630 nm）检测，依据吸收光谱和保留时间鉴定着色剂。定量 — 依据标准品校准曲线。

应用领域

关键参数

参数数值
测定范围0,5–500 mg/kg（视着色剂和基质而定）
检出限（LOD）0,1–0,5 mg/kg
定量限（LOQ）0,5–1,0 mg/kg
色谱柱C18（250 × 4,6 mm，5 µm）或 UHPLC C18（100 × 2,1 mm，1,8 µm）
检测波长427、482、520、630 nm（DAD：200–700 nm 全谱）
分析时间20–30 min（HPLC）、8–12 min（UHPLC）

标准

标准编号
PN-EN 12878:2014 (oraz metody wewnętrzne oparte na HPLC-DAD)
标准名称（波兰语）
Oznaczanie syntetycznych barwników w żywności metodą HPLC
标准名称（英语）
Determination of synthetic food colorants by HPLC

分步操作程序

  1. 样品制备

    将食品样品均质（搅拌机）。称取 2–5 g 于容量瓶中。

    ⏱ 时间: 10 min

  2. 着色剂提取

    加入 20 mL 甲醇/水/氨水混合液（70:25:5）。超声 15 min。过滤。

    ⏱ 时间: 20 min

  3. SPE 净化

    活化 SPE 小柱（5 mL 甲醇，5 mL 水）。上样。用 5 mL 水淋洗。用 5 mL 含氨甲醇洗脱着色剂。

  4. 浓缩与溶解

    在氮气流下将洗脱液蒸干（40°C）。用 1 mL 流动相 A 溶解残渣。经 0,22 µm 过滤至进样小瓶。

    ⏱ 时间: 15 min • 🌡 温度: 40°C

  5. 标准液配制

    用有证着色剂标准品在 0,5–50 µg/mL 范围内配制 5 点校准曲线。

  6. HPLC 分析

    将 10–20 µL 样品注入 C18 柱。梯度洗脱：25 min 内乙腈在 pH 7 乙酸铵缓冲液中由 0→50%。流速 1,0 mL/min。

    ⏱ 时间: 30 min

  7. 检测与定性

    在 427、482、520 和 630 nm 记录色谱图。依据保留时间和 UV-Vis 吸收光谱（DAD 谱库）鉴定着色剂。

  8. 定量测定

    由校准曲线计算着色剂浓度。计入稀释倍数和回收率。

  9. 质量控制

    分析空白样、加标样和 CRM。回收率 90–110%，重复性 RSD ≤ 5%。

    ⏱ 时间: 30 min

  10. 报告

    编制报告，结果以 mg/kg 表示，附不确定度并与 1333/2008 号法规限值比较。

所需设备与仪器

设备示例参考价格
带 DAD 检测器的 HPLC 系统Agilent 1260 Infinity II + DAD G7117C、Shimadzu Nexera + SPD-M40、Waters Alliance + 2998 PDA150 000–350 000 PLN
C18 色谱柱Agilent Zorbax Eclipse Plus C18、Waters Symmetry C18、Phenomenex Kinetex C181 500–3 500 PLN
SPE 系统（固相萃取）Supelco Visiprep SPE 歧管，Oasis HLB 或聚酰胺小柱2 000–5 000 PLN（歧管）
超声波清洗槽Bandelin Sonorex、Elma S、Branson 28003 000–8 000 PLN
分析天平Mettler Toledo MS205DU、RADWAG AS 220.R28 000–25 000 PLN

试剂、培养基与耗材

试剂CAS详情
着色剂标准品（有证 CRM）—柠檬黄 E102、日落黄 E110、偶氮玉红 E122、丽春红 4R E124、诱惑红 E129、亮蓝 E133 — Sigma-Aldrich、Dr. Ehrenstorfer
乙腈（HPLC 级）75-05-8纯度 ≥ 99,9%，用于流动相和提取
甲醇（HPLC 级）67-56-1用于从食品基质中提取着色剂
乙酸铵631-61-8配制流动相缓冲液用（pH 7,0，浓度 0,02 mol/L）
氨水 25%1336-21-6使提取相碱化 — 有助于着色剂溶解
SPE 小柱（聚酰胺/C18）—用于净化含脂肪和蛋白基质的提取液，500 mg/6 mL

职业健康与安全

常见问题

该检测依据哪项标准？

该检测依据的标准为 PN-EN 12878:2014 (oraz metody wewnętrzne oparte na HPLC-DAD) — 《Determination of synthetic food colorants by HPLC》。

该方法的原理是什么？

用水/甲醇/氨水混合液从食品样品中提取合成着色剂，经 SPE 小柱（聚酰胺或 C18）净化后，在 C18 柱上以梯度洗脱（流动相：pH 7 乙酸铵缓冲液 / 乙腈）进行液相色谱分离。用 DAD（二极管阵列检测器）在多个波长（427 nm、482 nm、520 nm、630 nm）检测，依据吸收光谱和保留时间鉴定着色剂。

测量范围和准确度是多少？

测定范围：0,5–500 mg/kg（视着色剂和基质而定）；检出限（LOD）：0,1–0,5 mg/kg；定量限（LOQ）：0,5–1,0 mg/kg；色谱柱：C18（250 × 4,6 mm，5 µm）或 UHPLC C18（100 × 2,1 mm，1,8 µm）。

完成检测需要多长时间？

各步骤所列时间合计约为 1 小时 45 分钟。整个程序共 10 个步骤。

需要哪些设备？

带 DAD 检测器的 HPLC 系统、C18 色谱柱、SPE 系统（固相萃取）、超声波清洗槽、分析天平。核心仪器的参考价格（带 DAD 检测器的 HPLC 系统）：150 000–350 000 PLN。

该检测用于哪些场景？

卫生监督部门（SANEPID）的官方食品控制；碳酸饮料、果汁、糖浆质量控制；糖果、软糖、果冻中偶氮染料检验；香辛料和酱料分析（姜黄素与柠檬黄的区分）；儿童食品控制（欧盟限制 — 需附加标识）；进口食品中未经批准着色剂（苏丹红 I–IV）检验；膳食补充剂中着色剂监测。

需要采取哪些安全防护措施？

乙腈 — 有毒（吸入、皮肤接触），须在通风柜中操作；甲醇 — 有毒、易燃（闪点 11°C）— 须在通风柜中操作，不得有明火；氨水 — 腐蚀性，刺激呼吸道 — 须在通风柜中操作并戴护目镜和手套；着色剂标准品 — 部分偶氮染料可能致敏，须戴手套；HPLC 废液（流动相）— 收集于有机废物容器中。

哪家实验室可以开展此项检测？

该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN 12878。

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