🦠 食品中的大肠菌群——月桂基胰蛋白胨肉汤中的检出与MPN测定
三句话速览
用样品和稀释液接种三支双倍浓度和三支单倍浓度的带杜氏小管的月桂基胰蛋白胨肉汤（LST），在30 °C或37 °C下培养24–48 h，把产气或浑浊的试管转接到含乳糖、胆汁和亮绿的肉汤中，24–48 h后由表格查得MPN；范围为1–100 CFU/g或ml。该检测依据 PN-ISO 4831:2007 (ISO 4831:2006)；测定范围：1–100 CFU/ml或g（MPN，每个稀释度3支试管）。整个程序共 6 个步骤；主要用于：检出规定量产品（如1 g/1 ml）中大肠菌群的存在——工厂中的卫生控制、测定乳和乳制品（30 °C）、冰淇淋、熟食制品中少量的大肠菌群（1–100 CFU/g）、来自食品生产和流通区域的环境样品。
要点速览
- 标准: PN-ISO 4831:2007 (ISO 4831:2006)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 测定范围: 1–100 CFU/ml或g（MPN，每个稀释度3支试管）
- 培养: 30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C；双倍浓度24 h ± 2 h；单倍浓度24 h ± 2 h，不产气时再培养24 h ± 2 h
- LST肉汤: pH 6.8 ± 0.2；10 ml；121 °C 15 min；双倍浓度不带杜氏小管（20 × 200 mm）
概述
ISO 4831:2006给出了检出和测定供人食用和动物饲用产品以及食品生产和流通环境样品中大肠菌群数量的一般指南；数量以在液体培养基中于30 °C或37 °C培养后的最可能数（MPN）表示（温度由各方商定；乳和乳制品为30 °C）。当预期数量为每ml或每g 1–100个时，该测定方法适用。它不如ISO 4832的平板法精密，但能检验较大的份量并检出每克中较少的细菌；两项标准中“大肠菌群”的定义不同。此处把大肠菌群定义为在商定温度下发酵乳糖并产气的细菌；被称为大肠菌群的菌株中有一部分（包括E. coli）产气不足，无法在杜氏小管中检出（不产气菌株），因此该方法检不出全部“推定大肠菌群”（如某些Citrobacter、Enterobacter、Klebsiella）。其局限是方法的变异性大（第11章）。在UWM（瓦尔米亚－马祖里大学）的讲义中，同一方法被描述为在含月桂基硫酸钠的培养基中作三管法MPN测定（30 °C/48 h），并在含乳糖、胆汁和亮绿的培养基中确证。
方法原理
检出：用一份样品接种一支选择性增菌肉汤，在30 °C或37 °C下培养24 h或48 h；把浑浊或产气的试管转接到确证培养基中（24 h或48 h）；浑浊并产气即确证有大肠菌群。MPN测定：用规定量的液体样品或初始悬液接种三支双倍浓度的肉汤，用同样的量接种三支单倍浓度的肉汤，再用十倍稀释液接种后续的单倍浓度试管；双倍浓度的培养24 h，单倍浓度的培养24 h或48 h，随后检查产气情况或是否浑浊到无法判断产气；把双倍浓度的培养物以及产气／浑浊的单倍浓度培养物转接到确证肉汤中，培养24 h或48 h，并由产气试管的数目从表格中查得MPN。月桂基胰蛋白胨肉汤（LST）：每1000 ml含乳和动物蛋白水解物20 g（双倍浓度为40 g）、乳糖5 g（10 g）、K₂HPO₄ 2.75 g（5.5 g）、KH₂PO₄ 2.75 g（5.5 g）、NaCl 5 g（10 g）、月桂基硫酸钠0.1 g（0.2 g）；pH 6.8 ± 0.2；按每支10 ml分装于带杜氏小管的16 × 160 mm试管（单倍浓度）或不带小管的20 × 200 mm试管（双倍浓度）中；121 °C 15 min。确证肉汤：酪蛋白水解物10 g、乳糖10 g、干牛胆汁20 g、亮绿0.0133 g/l；pH 7.2 ± 0.2；10 ml，带杜氏小管。灭菌后杜氏小管中不得含有气泡。
应用领域
- 检出规定量产品（如1 g/1 ml）中大肠菌群的存在——工厂中的卫生控制
- 测定乳和乳制品（30 °C）、冰淇淋、熟食制品中少量的大肠菌群（1–100 CFU/g）
- 来自食品生产和流通区域的环境样品
- 平板法灵敏度不足时的饲料和原料
- 企业标准和客户规范中的附加准则
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 测定范围 | 1–100 CFU/ml或g（MPN，每个稀释度3支试管） |
| 培养 | 30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C；双倍浓度24 h ± 2 h；单倍浓度24 h ± 2 h，不产气时再培养24 h ± 2 h |
| LST肉汤 | pH 6.8 ± 0.2；10 ml；121 °C 15 min；双倍浓度不带杜氏小管（20 × 200 mm） |
| 确证 | 含乳糖、胆汁和亮绿的肉汤，24 h ± 2 h或48 h ± 2 h；阳性 = 杜氏小管中产气 |
| 检出 | x ml样品：1 < x < 10 ml → 10 ml双倍浓度肉汤；x ≤ 1 ml → 10 ml单倍浓度肉汤 |
| 限制 | 不产气菌株（无可检出的气体）不能被检出 |
标准
- 标准编号
- PN-ISO 4831:2007 (ISO 4831:2006)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby bakterii z grupy coli — Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby
- 标准名称（英语）
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of coliforms — Most probable number technique
分步操作程序
-
样品
按ISO 6887（相应部分）、ISO 8261或产品标准制备样品、初始悬液和十倍稀释液。
-
检出——接种
按所要求的检出限，把x ml样品或悬液移入10 ml双倍浓度肉汤（1 ml < x < 10 ml）或单倍浓度肉汤（x ≤ 1 ml）；培养24 h ± 2 h（双倍浓度）或24 h ± 2 h、不产气／不浑浊时再培养24 h ± 2 h（单倍浓度）。
-
检出——确证
从双倍浓度试管以及产气或浑浊的单倍浓度试管中用接种环转接到确证肉汤；培养24 h ± 2 h，不产气时至48 h ± 2 h；产气的试管 = 阳性（x g/ml中有大肠菌群）。
-
MPN——接种
用规定量的样品或初始悬液接种三支双倍浓度肉汤和三支单倍浓度肉汤，再用十倍稀释液接种后续的每三支单倍浓度试管（至少三个连续的稀释度）。
-
MPN——培养与转接
按上述培养；把双倍浓度的培养物以及产气或浑浊到无法判断产气的单倍浓度培养物转接到确证肉汤中，培养24 h或48 h。
-
MPN读数
由每一系列中产气的确证试管数从表格查得每ml或每g的MPN；解释时考虑方法的变异性（第11章）；报告中给出培养温度和偏离。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C | — | |
| 16 × 160 mm和20 × 200 mm试管、杜氏小管 | 灭菌后小管中无气泡 | — |
| 1 ml和10 ml移液管、约3 mm的Pt-Ir/Ni-Cr接种环或一次性接种环 | — | |
| pH计（25 °C下 ± 0.1 pH） | — | |
| 高压灭菌器和干燥箱 | 按ISO 7218 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 月桂基胰蛋白胨肉汤（LST）——单倍浓度和双倍浓度 | — | 大肠菌群的选择性增菌；月桂基硫酸钠抑制伴随菌群 |
| 含乳糖、胆汁和亮绿的肉汤（BGLB） | — | 确证乳糖发酵产气 |
| 按ISO 6887 / ISO 8261的稀释液 | — | 初始悬液和稀释液 |
职业健康与安全
- 培养物可能含有致病性Enterobacteriaceae——在微生物实验室条件下操作，对废弃物高压灭菌
- 亮绿和胆盐——称量时避免扬尘
- 杜氏小管——打开产气的试管时须小心
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-ISO 4831:2007 (ISO 4831:2006) — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of coliforms — Most probable number technique》。
该方法的原理是什么？
检出：用一份样品接种一支选择性增菌肉汤，在30 °C或37 °C下培养24 h或48 h；把浑浊或产气的试管转接到确证培养基中（24 h或48 h）；浑浊并产气即确证有大肠菌群。MPN测定：用规定量的液体样品或初始悬液接种三支双倍浓度的肉汤，用同样的量接种三支单倍浓度的肉汤，再用十倍稀释液接种后续的单倍浓度试管；双倍浓度的培养24 h，单倍浓度的培养24 h或48 h，随后检查产气情况或是否浑浊到无法判断产气；把双倍浓度的培养物以及产气／浑浊的单倍浓度培养物转接到确证肉汤中，培养24 h或48 h，并由产气试管的数目从表格中查得MPN。
测量范围和准确度是多少？
测定范围：1–100 CFU/ml或g（MPN，每个稀释度3支试管）；培养：30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C；双倍浓度24 h ± 2 h；单倍浓度24 h ± 2 h，不产气时再培养24 h ± 2 h；LST肉汤：pH 6.8 ± 0.2；10 ml；121 °C 15 min；双倍浓度不带杜氏小管（20 × 200 mm）；确证：含乳糖、胆汁和亮绿的肉汤，24 h ± 2 h或48 h ± 2 h；阳性 = 杜氏小管中产气。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C、16 × 160 mm和20 × 200 mm试管、杜氏小管、1 ml和10 ml移液管、约3 mm的Pt-Ir/Ni-Cr接种环或一次性接种环、pH计（25 °C下 ± 0.1 pH）、高压灭菌器和干燥箱。
该检测用于哪些场景？
检出规定量产品（如1 g/1 ml）中大肠菌群的存在——工厂中的卫生控制；测定乳和乳制品（30 °C）、冰淇淋、熟食制品中少量的大肠菌群（1–100 CFU/g）；来自食品生产和流通区域的环境样品；平板法灵敏度不足时的饲料和原料；企业标准和客户规范中的附加准则。
需要采取哪些安全防护措施？
培养物可能含有致病性Enterobacteriaceae——在微生物实验室条件下操作，对废弃物高压灭菌；亮绿和胆盐——称量时避免扬尘；杜氏小管——打开产气的试管时须小心。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-ISO 4831。