🦠 食品中的大肠菌群——平板法（VRBL琼脂倾注培养）
三句话速览
把1 ml样品或其稀释液分别倾注接种于两个平板，倒入15 ml VRBL琼脂（44–47 °C），凝固后加铺4 ml覆盖层，在30 °C或37 °C下培养24 h；计数 ≥ 0。该检测依据 PN-ISO 4832:2007 (ISO 4832:2006)；推荐范围：> 100 CFU/ml或/g；平板上10–150个菌落。整个程序共 7 个步骤；主要用于：预期大肠菌群数 > 100/g时的食品生产卫生控制（肉类、乳制品、熟食制品）、乳和乳制品——在30 °C下培养、来自食品生产和流通区域的环境样品。
要点速览
- 标准: PN-ISO 4832:2007 (ISO 4832:2006)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 7
- 培养: 30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C（各方商定；乳为30 °C），24 h ± 2 h
- 推荐范围: > 100 CFU/ml或/g；平板上10–150个菌落
- VRBL培养基: pH 7.4 ± 0.2；煮沸2 min，不高压灭菌；4 h内用完；底层约15 ml + 覆盖层约4 ml，温度44–47 °C
概述
ISO 4832:2006给出了用菌落计数法测定供人食用和动物饲用产品以及食品生产和流通环境样品中大肠菌群数量的一般指南，即在固体培养基上于30 °C或37 °C培养后计数（温度由各方商定；乳和乳制品为30 °C）。当预期菌落数超过每ml或每g 100个时推荐采用该技术。它比ISO 4831的MPN法更精密，但不能检验那么大的份量，因此在细菌数量多时优先采用；两项标准中“大肠菌群”的定义不同，故所测定的微生物未必相同。此处把大肠菌群定义为在商定温度下在含结晶紫、中性红、胆汁和乳糖的琼脂上形成特征性菌落、并在确证试验中发酵乳糖产气的细菌；该方法平均检出其他出版物中所称“推定大肠菌群”菌株的约90 %（如某些Citrobacter、Enterobacter、Klebsiella）。精密度：按泊松分布，置信限为 ± 16 %至 ± 52 %；实验室间试验中sr = 0.20 log，sR = 0.35 log。在学术讲义（UWM，瓦尔米亚－马祖里大学）中，该方法列为食品生产者测定的“附加准则”：接种VRBL琼脂，37 °C/24 h，计数被红色区域环绕的深紫红色菌落。
方法原理
用规定量的样品（液体产品）或初始悬液以倾注法制备两个平板，并用十倍稀释液制备后续的成对平板；平板在30 °C或37 °C下培养24 h；计数特征性菌落，必要时确证乳糖发酵；每ml或每g的细菌数按ISO 7218计算。VRBL培养基（含结晶紫、中性红、胆汁和乳糖的琼脂）：动物组织酶解物7 g、酵母浸膏3 g、乳糖10 g、NaCl 5 g、胆盐1.5 g、中性红0.03 g、结晶紫0.002 g、琼脂12–18 g、水1000 ml；煮沸后pH在25 °C为7.4 ± 0.2；把培养基加热至沸腾，煮沸2 min，立即在44–47 °C水浴中冷却，不得高压灭菌，也不得重新加热，须在4 h内用完，并用对照平板检查无菌性。确证培养基——含乳糖、胆汁和亮绿的肉汤（酪蛋白水解物10 g、乳糖10 g、干牛胆汁20 g、亮绿0.0133 g/l；pH 7.2 ± 0.2；按每支10 ml分装于带杜氏小管的试管中；121 °C 15 min）。从初始悬液制备完毕到倾注平板的时间不得超过15 min。
应用领域
- 预期大肠菌群数 > 100/g时的食品生产卫生控制（肉类、乳制品、熟食制品）
- 乳和乳制品——在30 °C下培养
- 来自食品生产和流通区域的环境样品
- 饲料和植物性原料
- 企业标准和客户规范范围内的检验（第2073/2005号条例之外的附加准则）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养 | 30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C（各方商定；乳为30 °C），24 h ± 2 h |
| 推荐范围 | > 100 CFU/ml或/g；平板上10–150个菌落 |
| VRBL培养基 | pH 7.4 ± 0.2；煮沸2 min，不高压灭菌；4 h内用完；底层约15 ml + 覆盖层约4 ml，温度44–47 °C |
| 典型菌落 | 紫红色，≥ 0.5 mm，有时带胆汁沉淀的红色区域——无需确证 |
| 确证 | 5个非典型菌落 → 含乳糖、胆汁和亮绿的肉汤，24 h ± 2 h；杜氏小管中产气 |
| 精密度 | sr = 0.20 log；sR = 0.35 log；置信限 ± 16 %至 ± 52 % |
| 至倾注的时间 | 自初始悬液制备起 ≤ 15 min |
标准
- 标准编号
- PN-ISO 4832:2007 (ISO 4832:2006)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby bakterii z grupy coli — Metoda płytkowa
- 标准名称（英语）
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of coliforms — Colony-count technique
分步操作程序
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样品与稀释
按ISO 6887（相应部分）、ISO 8261或产品标准制备样品、初始悬液和十倍稀释液。
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接种
用无菌移液管向两个平板中的每一个的中央移入1 ml液体产品或所选稀释液（每个稀释度用单独的移液管）。
-
倾注培养基
向每个平板倒入约15 ml温度为44–47 °C的VRBL（不迟于初始悬液制备后15 min），小心混匀并置于冰冷的水平面上凝固；另制备一个装15 ml培养基的对照平板以检查无菌性。
-
覆盖层
完全凝固后在表面加铺约4 ml VRBL（44–47 °C）并静置凝固。
-
培养
把平板倒置，在30 °C或37 °C（按商定）下培养24 h ± 2 h。
-
计数
选择有10–150个菌落的平板；计数直径 ≥ 0.5 mm的紫红色菌落（有时带胆汁沉淀的浅红色区域）——属典型菌落，无需确证。对非典型菌落（如较小的菌落）以及含乳糖以外糖类的乳制品的全部菌落，既要计数也要确证。
-
确证与结果
每种非典型类型各取五个菌落接种到含乳糖、胆汁和亮绿的肉汤中，在同一温度下培养24 h ± 2 h；把在杜氏小管中产气的菌落判为大肠菌群并计入计算；结果按ISO 7218；报告中给出培养温度、采样方法和偏离。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C | — | |
| 44–47 °C和100 °C水浴 | 培养基的冷却和煮沸 | — |
| 90–100 mm培养皿、1 ml移液管、带杜氏小管的16 × 160 mm试管 | — | |
| 带透光底座的菌落计数器 | 机械式或电子式 | — |
| pH计（25 °C下 ± 0.1 pH）、约3 mm的Pt-Ir或Ni-Cr接种环或一次性接种环 | — | |
| 用于灭菌的高压灭菌器和干燥箱 | 按ISO 7218 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| VRBL琼脂（结晶紫中性红胆盐乳糖）（动物组织酶解物7 g、酵母浸膏3 g、乳糖10 g、NaCl 5 g、胆盐1.5 g、中性红0.03 g、结晶紫0.002 g、琼脂12–18 g/l） | — | 选择性－鉴别性培养基；pH 7.4 ± 0.2 |
| 含乳糖、胆汁和亮绿的肉汤（酪蛋白水解物10 g、乳糖10 g、牛胆汁20 g、亮绿0.0133 g/l） | — | 确证乳糖发酵产气；pH 7.2 ± 0.2 |
| 按ISO 6887 / ISO 8261的稀释液 | — | 初始悬液和十倍稀释液 |
职业健康与安全
- VRBL培养基的煮沸和44–47 °C琼脂的操作——防止烫伤；不得重新加热培养基
- 培养物可能含有致病性Enterobacteriaceae——遵守良好微生物学操作规范，对废弃物高压灭菌
- 结晶紫和亮绿——称量时避免接触皮肤和扬尘
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-ISO 4832:2007 (ISO 4832:2006) — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of coliforms — Colony-count technique》。
该方法的原理是什么？
用规定量的样品（液体产品）或初始悬液以倾注法制备两个平板，并用十倍稀释液制备后续的成对平板；平板在30 °C或37 °C下培养24 h；计数特征性菌落，必要时确证乳糖发酵；每ml或每g的细菌数按ISO 7218计算。VRBL培养基（含结晶紫、中性红、胆汁和乳糖的琼脂）：动物组织酶解物7 g、酵母浸膏3 g、乳糖10 g、NaCl 5 g、胆盐1.
测量范围和准确度是多少？
培养：30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C（各方商定；乳为30 °C），24 h ± 2 h；推荐范围：> 100 CFU/ml或/g；平板上10–150个菌落；VRBL培养基：pH 7.4 ± 0.2；煮沸2 min，不高压灭菌；4 h内用完；底层约15 ml + 覆盖层约4 ml，温度44–47 °C；典型菌落：紫红色，≥ 0.5 mm，有时带胆汁沉淀的红色区域——无需确证。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 7 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱30 °C ± 1 °C或37 °C ± 1 °C、44–47 °C和100 °C水浴、90–100 mm培养皿、1 ml移液管、带杜氏小管的16 × 160 mm试管、带透光底座的菌落计数器、pH计（25 °C下 ± 0.1 pH）、约3 mm的Pt-Ir或Ni-Cr接种环或一次性接种环、用于灭菌的高压灭菌器和干燥箱。
该检测用于哪些场景？
预期大肠菌群数 > 100/g时的食品生产卫生控制（肉类、乳制品、熟食制品）；乳和乳制品——在30 °C下培养；来自食品生产和流通区域的环境样品；饲料和植物性原料；企业标准和客户规范范围内的检验（第2073/2005号条例之外的附加准则）。
需要采取哪些安全防护措施？
VRBL培养基的煮沸和44–47 °C琼脂的操作——防止烫伤；不得重新加热培养基；培养物可能含有致病性Enterobacteriaceae——遵守良好微生物学操作规范，对废弃物高压灭菌；结晶紫和亮绿——称量时避免接触皮肤和扬尘。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-ISO 4832。