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🧫 食品中蜡样芽孢杆菌

微生物 PN-EN ISO 7932

采用表面涂布法在 MYP（甘露醇-蛋黄-多黏菌素）琼脂上于 30°C 计数食品中的疑似蜡样芽孢杆菌，并以溶血试验确证。

要点速览

  • 标准: PN-EN ISO 7932:2005
  • 类别: 微生物
  • 操作步骤数: 8
  • 各步骤合计时间: 1 天 19 小时 40 分钟–2 天 1 小时 40 分钟
  • 培养温度: 30 ± 1°C
  • 培养时间: 18–24 h（MYP）、24 ± 2 h（溶血）
  • 培养基: MYP 琼脂（甘露醇-蛋黄-多黏菌素，Mossel 培养基）

概述

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是革兰氏阳性、需氧、产芽孢的细菌，在环境中广泛分布——存在于土壤、灰尘、植物和许多食品原料中。蜡样芽孢杆菌可引起两类食物中毒：呕吐型（由呕吐毒素 cereulide 引起，潜伏期 1–5 h）和腹泻型（由 Hbl、Nhe、CytK 肠毒素引起，潜伏期 8–16 h）。

PN-EN ISO 7932 标准规定了通过菌落计数测定疑似蜡样芽孢杆菌的水平法。培养基基于三种鉴别机制：蜡样芽孢杆菌不能发酵甘露醇（酚红背景上的粉红色菌落）、产卵磷脂酶（蛋黄形成的菌落周围白色沉淀圈）以及对多黏菌素 B 的耐药性（抑制革兰氏阴性菌）。

之所以称为"疑似"，是因为该方法无法将蜡样芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌广义群中的近缘种（B. thuringiensis、B. mycoides、B. weihenstephanensis、B. anthracis）完全区分开。确证依据羊血琼脂上的溶血试验。

该方法为大米、面食、酱料、香辛料、乳制品、婴幼儿食品和即食餐食的质量控制所必需。蜡样芽孢杆菌在餐饮业中风险尤为突出——冷却和复热环节的失误有利于其大量繁殖。

方法原理

方法采用 MYP 培养基，其中甘露醇与酚红构成指示系统（蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇 — 粉红色菌落），蛋黄乳液用于检测卵磷脂酶（白色沉淀圈），多黏菌素 B 抑制革兰氏阴性菌生长。将样品表面涂布后于 30 ± 1°C 培养 24 h。蜡样芽孢杆菌的典型菌落较大（约 5 mm）、粉红色、粗糙干燥，周围有白色沉淀圈。确证采用溶血试验——蜡样芽孢杆菌在羊血琼脂上呈强β-溶血。

应用领域

关键参数

参数数值
培养温度30 ± 1°C
培养时间18–24 h（MYP）、24 ± 2 h（溶血）
培养基MYP 琼脂（甘露醇-蛋黄-多黏菌素，Mossel 培养基）
菌落特征较大（约 5 mm）、粉红色、干燥，带白色沉淀圈
接种方式表面涂布，每皿 0,1 mL
确证羊血琼脂溶血试验（β-溶血）

标准

标准编号
PN-EN ISO 7932:2005
标准名称（波兰语）
Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby domniemanego Bacillus cereus — Metoda liczenia kolonii w temperaturze 30°C
标准名称（英语）
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C

分步操作程序

  1. 样品制备

    称取 10 g 样品于均质袋中，加入 90 mL BPW，均质 60–120 s。制备十倍稀释系列。

    ⏱ 时间: 10 min

  2. MYP 培养基制备

    将 46 g MYP 琼脂基础溶于 900 mL 蒸馏水。高压灭菌（121°C/15 min）。冷却至 45–50°C，无菌加入 100 mL 蛋黄乳液和多黏菌素 B 溶液。每皿倾注 15–20 mL，凝固并烘干。

    ⏱ 时间: 45 min • 🌡 温度: 45–50°C

  3. 表面涂布

    取各稀释度 0,1 mL 加于 MYP 平板表面。用涂布棒涂布。静置至接种物被吸收（约 15 min）。

    ⏱ 时间: 10 min

  4. 培养

    将平板倒置，在需氧条件下于 30 ± 1°C 培养 18–24 h。

    ⏱ 时间: 18–24 h • 🌡 温度: 30°C

  5. MYP 上菌落读取

    计数蜡样芽孢杆菌典型菌落：较大（约 5 mm）、粉红色（甘露醇阴性）、周围有白色沉淀圈（卵磷脂酶 +）。同时计数非典型菌落（粉红色但无沉淀）。

    ⏱ 时间: 15 min

  6. 溶血试验（确证）

    挑取至少 5 个典型和 5 个非典型菌落。划线接种于羊血琼脂，使菌落分开以便评价溶血。30°C 培养 24 ± 2 h。

    ⏱ 时间: 24 h • 🌡 温度: 30°C

  7. 溶血评价

    蜡样芽孢杆菌呈强β-溶血（菌落周围透明）。计算确证分离株的百分比。

    ⏱ 时间: 10 min

  8. 计算与报告

    结合确证菌落百分比计算疑似蜡样芽孢杆菌数。结果以 CFU/g 表示。报告表述为"疑似蜡样芽孢杆菌"。

    ⏱ 时间: 10 min

所需设备与仪器

设备示例参考价格
30°C 实验室培养箱Binder BD 56、Memmert INB 200、POL-EKO CLN 535 000–18 000 PLN
II 级生物安全柜Thermo Scientific MSC-Advantage、ESCO Airstream AC225 000–60 000 PLN
拍击式均质器Seward Stomacher 400 Circulator、BagMixer 40012 000–25 000 PLN
44–47°C 水浴Memmert WNB 14、Julabo TW 123 000–10 000 PLN
实验室高压灭菌器Tuttnauer 2540M、Systec VX-6515 000–45 000 PLN

试剂、培养基与耗材

试剂CAS详情
MYP 琼脂基础（Mossel 培养基）69-65-8蛋白胨、肉浸粉、甘露醇、氯化钠、酚红、琼脂；500 g 装
蛋黄乳液（50%）—MYP 补充剂 — 检测卵磷脂酶活性，每 900 mL 培养基加 100 mL
多黏菌素 B（选择性补充剂）1405-20-5抑制革兰氏阴性菌的抗生素；工作浓度 100 IU/mL；10 瓶装
羊血琼脂（哥伦比亚血琼脂）—用于溶血试验 — 蜡样芽孢杆菌确证（β-溶血）；成品平板
D-甘露醇69-65-8糖醇 — MYP 中的指示系统（蜡样芽孢杆菌甘露醇阴性）
酚红143-74-8MYP 培养基中的 pH 指示剂 — 发酵甘露醇时变色
缓冲蛋白胨水（BPW）—用于样品稀释，500 g 装

职业健康与安全

常见问题

该检测依据哪项标准？

该检测依据的标准为 PN-EN ISO 7932:2005 — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C》。

该方法的原理是什么？

方法采用 MYP 培养基，其中甘露醇与酚红构成指示系统（蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇 — 粉红色菌落），蛋黄乳液用于检测卵磷脂酶（白色沉淀圈），多黏菌素 B 抑制革兰氏阴性菌生长。将样品表面涂布后于 30 ± 1°C 培养 24 h。

测量范围和准确度是多少？

培养温度：30 ± 1°C；培养时间：18–24 h（MYP）、24 ± 2 h（溶血）；培养基：MYP 琼脂（甘露醇-蛋黄-多黏菌素，Mossel 培养基）；菌落特征：较大（约 5 mm）、粉红色、干燥，带白色沉淀圈。

完成检测需要多长时间？

各步骤所列时间合计约为 1 天 19 小时 40 分钟–2 天 1 小时 40 分钟。整个程序共 8 个步骤。

需要哪些设备？

30°C 实验室培养箱、II 级生物安全柜、拍击式均质器、44–47°C 水浴、实验室高压灭菌器。核心仪器的参考价格（30°C 实验室培养箱）：5 000–18 000 PLN。

该检测用于哪些场景？

大米、面食和谷物制品质量控制；酱料、香辛料及调味料检验；乳制品控制（乳粉、奶酪）；婴幼儿食品和代乳配方检验；即食食品和餐饮配餐监测；HACCP 体系验证 — 储存温度控制；植物性原料分析（面粉、淀粉、草本茶）。

需要采取哪些安全防护措施？

蜡样芽孢杆菌 — 可产毒素的 BSL-2 病原菌，须使用个人防护装备；蜡样芽孢杆菌芽孢可耐受高压灭菌 — 须格外谨慎；多黏菌素 B — 抗生素，避免皮肤接触和吸入；必须在 II 级生物安全柜中操作；使用过的材料须先高压灭菌（121°C/30 min）再废弃；用杀孢子剂（如 3% 过氧化氢）对台面消毒。

哪家实验室可以开展此项检测？

该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 7932。

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