🍎 肉制品中的硝酸盐与亚硝酸盐——硝酸盐还原酶还原、格里斯反应、540 nm分光光度法
三句话速览
10 g均质试样的水提取液（pH 8.0～8。该检测依据 PN-EN 12014-3:2006；验证范围：亚硝酸盐9～22 mg/kg（NaNO2）与硝酸盐23～48 mg/kg（NaNO3）；以NaNO2计总量5～125 mg/kg适用。整个程序共 9 个步骤（合计约 46 分钟）；主要用于：灌肠制品、罐头与熟食制品中亚硝酸盐与硝酸盐（E249～E252）含量的控制、肉制品中添加剂限量的官方监督、腌制过程与灌肠制品成熟过程中硝酸盐转化的研究。
要点速览
- 标准: PN-EN 12014-3:2006
- 类别: 食品化学
- 操作步骤数: 9
- 各步骤合计时间: 46 分钟
- 验证范围: 亚硝酸盐9～22 mg/kg（NaNO2）与硝酸盐23～48 mg/kg（NaNO3）；以NaNO2计总量5～125 mg/kg适用
- 试样量与萃取: 10 g（准确至10 mg），50 ml水 + 50 ml热水，pH 8.0～8.5，沸水浴15 min，200 ml容量瓶
- 澄清: 各4 ml卡雷兹1号与2号溶液；折叠滤纸，弃去最初20 ml滤液
概述
本标准规定了测定肉制品中硝酸盐与亚硝酸盐含量的分光光度方法，已针对亚硝酸盐含量9～22 mg/kg（以亚硝酸钠计）与硝酸盐含量23～48 mg/kg（以硝酸钠计）的各类产品进行验证；经验表明，该方法也适用于以亚硝酸钠计总量5～125 mg/kg的情形。EN 12014-3:2005代替ENV 12014-3:1998，属于“Oznaczanie zawartości azotanów i/lub azotynów”［硝酸盐和/或亚硝酸盐含量的测定］系列（第2部分：蔬菜的HPLC/IC，第4部分：肉制品的IC，第5部分：婴儿食品的酶法，第7部分：镉还原后的流动法）。本说明依据EN 12014-3:2005的预览内容（至6.2.1条）编写；PN-EN 12014-3:2006及其Ap1:2008修改单列入QAFP体系罐头行业分册的检验方法目录。
硝酸钠与硝酸钾（E251、E252）以及亚硝酸钾与亚硝酸钠（E249、E250）在肉类加工中用作添加剂：亚硝酸盐赋予制品粉红色的腌制色泽（亚硝基肌红蛋白）、香气与腌制风味，并具有抗氧化作用，可抑制肉毒梭菌与产气荚膜梭菌的生长，而硝酸盐则是其贮库，腌制过程中由其生成亚硝酸盐；然而亚硝酸钠具有潜在致癌性（亚硝胺）并可引起高铁血红蛋白血症。按Bromatologia i Chemia Toksykologiczna（2009）所引用的规定，亚硝酸盐只能以含0.5～0.6 % NaNO2的NaCl混合物形式使用，萨拉米中亚硝酸盐含量应低于60 mg/kg，亚硝酸盐与硝酸盐之和不得超过600 mg/kg；其余灌肠制品、熟食制品与巴氏杀菌罐头中的总含量不得超过125 mg/kg。
亚硝酸盐测定的原理基于格里斯反应：亚硝酸盐与磺胺生成重氮盐，后者与N-(1-萘基)乙二胺偶联生成红色偶氮染料；提取液中的硝酸盐用硝酸盐还原酶（代替镉柱）还原为亚硝酸盐，并由两次测定的差值计算。
方法原理
取10 g（准确至10 mg）均质试样（温度低于25 °C；孔径 ≤ 4.5 mm的绞肉机，绞两遍），与约50 ml水均质30～60 s，用50 ml热水冲洗，用约1 mol/l的NaOH溶液将pH调至8.0～8.5，并在沸水浴中加热15 min，其间振摇。冷却后将提取液转入200 ml容量瓶，加入各4 ml卡雷兹1号溶液（每升含150 g亚铁氰化钾）与2号溶液（每升含230 g乙酸锌），加水定容并通过不含硝酸盐与亚硝酸盐的折叠滤纸过滤，弃去最初20 ml。亚硝酸盐：取2.0 ml溶液与1.0 ml水和3.0 ml显色试剂混合液混合（等体积的每升含8 g磺胺与330 ml HCl的溶液与250 ml中含0.330 g N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐的溶液），避光放置，30 min后以水为参比于540 nm测定吸光度。硝酸盐：取部分提取液与pH 7.8咪唑缓冲液、含FAD的NADPH以及硝酸盐还原酶（Aspergillus sp.，EC 1.6.6.2）一同温育——生成的亚硝酸盐连同原有亚硝酸盐一起与显色试剂反应；硝酸盐含量由差值计算。校准曲线用亚硝酸钠溶液（200 ml中含0.13～0.53 mg NO2−）与硝酸钾溶液（换算为亚硝酸盐0.14～0.55 mg）绘制，其制备须与样品一样经卡雷兹澄清。
应用领域
- 灌肠制品、罐头与熟食制品中亚硝酸盐与硝酸盐（E249～E252）含量的控制
- 肉制品中添加剂限量的官方监督
- 腌制过程与灌肠制品成熟过程中硝酸盐转化的研究
- QAFP质量体系肉类罐头的检验方法
- 无镉方法——减少有毒废物的实验室中替代镉还原法的方案
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 验证范围 | 亚硝酸盐9～22 mg/kg（NaNO2）与硝酸盐23～48 mg/kg（NaNO3）；以NaNO2计总量5～125 mg/kg适用 |
| 试样量与萃取 | 10 g（准确至10 mg），50 ml水 + 50 ml热水，pH 8.0～8.5，沸水浴15 min，200 ml容量瓶 |
| 澄清 | 各4 ml卡雷兹1号与2号溶液；折叠滤纸，弃去最初20 ml滤液 |
| 显色反应 | 2.0 ml溶液 + 1.0 ml水 + 3.0 ml试剂混合液，避光30 min，540 nm以水为参比 |
| 酶促还原 | pH 7.8咪唑缓冲液；50 ml缓冲液中含125 mg NADPH-Na4与2.5 mg FAD；10 ml含50 mg EDTA的缓冲液中含11 mg硝酸盐还原酶（约0.4 U/mg）（4 °C下约可保存14天） |
| 标准 | NaNO2 400 mg/l → 20 mg/l → 每200 ml含0.13、0.27、0.40、0.53 mg NO2−；KNO3 600 mg/l → 30 mg/l → 以亚硝酸盐计0.14～0.55 mg |
标准
- 标准编号
- PN-EN 12014-3:2006
- 标准名称（波兰语）
- Artykuły żywnościowe — Oznaczanie zawartości azotanów i/lub azotynów — Część 3: Spektrometryczne oznaczanie zawartości azotanów i azotynów w produktach mięsnych po enzymatycznej redukcji azotanów do azotynów
- 标准名称（英语）
- Foodstuffs — Determination of nitrate and/or nitrite content — Part 3: Spectrometric determination of nitrate and nitrite content of meat products after enzymatic reduction of nitrate to nitrite
分步操作程序
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均质
将实验室样品均质，使温度不超过25 °C；使用绞肉机时至少绞两遍。
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萃取
称取10 g（准确至10 mg）至广口锥形瓶中，加入约50 ml水，均质30～60 s，用50 ml热水冲洗均质机轴杆。用NaOH溶液将pH调至8.0～8.5（pH计）；生制品不得超过8.5，烫煮与蒸煮制品可至约9.5。
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加热
将瓶在沸水浴中加热15 min，其间振摇数次；冷却至室温。
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澄清
定量转入200 ml容量瓶，加入各4 ml卡雷兹1号与2号溶液，每次加入后振摇；加水定容，混匀，用折叠滤纸过滤并弃去最初20 ml滤液（样品溶液）。
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标准溶液
向一系列200 ml容量瓶中分别量取10、20、30与40 ml稀释后的亚硝酸钠溶液（0.13、0.27、0.40、0.53 mg NO2−），并另行量取硝酸钾溶液（以亚硝酸盐计0.14、0.27、0.41、0.55 mg），将pH调至8.0～8.5，加入各4 ml卡雷兹1号与2号溶液，定容，过滤并弃去最初20 ml。
-
亚硝酸盐的测定
在试管中将2.0 ml溶液（样品或标准）与1.0 ml水和3.0 ml显色试剂混合液混合，振摇并在室温下避光放置；30 min后以水为参比于540 nm测定吸光度。
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硝酸盐的测定
按标准第6章，将部分样品溶液（以及硝酸盐标准）与咪唑缓冲液、NADPH/FAD溶液和硝酸盐还原酶溶液温育，随后按亚硝酸盐的方式进行显色反应。
-
校准曲线与计算
以标准的吸光度对亚硝酸盐质量（200 ml中的mg）作图。读取样品中的亚硝酸盐含量与还原后的总含量；硝酸盐由差值计算，结果以每千克的mg NaNO2与mg NaNO3表示。
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检验报告
给出样品标识、对EN 12014-3的引用、亚硝酸盐与硝酸盐的结果、日期以及对本标准的偏离；精密度数据见附录A。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 均质机 | 高速旋转刀具或带孔径 ≤ 4.5 mm筛板的绞肉机 | — |
| 水浴 | 能保持100 °C | — |
| pH计 | 配玻璃电极与参比电极，用于将pH调至8.0～8.5 | — |
| 分光光度计 | 在540 nm测定；在540 nm处无吸收的玻璃或塑料比色皿 | — |
| 折叠滤纸 | 不含硝酸盐与亚硝酸盐 | — |
| 200 ml与500 ml容量瓶、移液管、试管 | 用于标准溶液与显色反应 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 磺胺 | 63-74-1 | 显色试剂1号：将8 g在水浴上溶于500 ml水中，冷却后加入330 ml 37 %盐酸（不含亚硝酸盐），定容至1 l；可保存数周 |
| N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐 | 1465-25-4 | 显色试剂2号：0.330 g溶于250 ml水中，装于深色瓶，每周更换；试剂混合液为1 + 1（体积比），使用当日配制 |
| 卡雷兹溶液 | 14459-95-1 | 1号：每升含150 g K4[Fe(CN)6]·3H2O（深色瓶，每两个月更换）；2号：每升含230 g二水乙酸锌（CAS 5970-45-6） |
| 亚硝酸钠 | 7632-00-0 | 贮备液400 mg/l（500 ml中含200 mg，称准至0.1 mg；4 °C下2周），稀释至20 mg/l |
| 硝酸钾 | 7757-79-1 | 贮备液600 mg/l（500 ml中含300 mg），稀释至30 mg/l |
| 咪唑、NADPH-Na4、FAD、硝酸盐还原酶 | 288-32-4 | 缓冲液：0.68 g咪唑溶于80 ml水中，用2 mol/l盐酸调至pH 7.8，定容至100 ml；含FAD的NADPH溶液使用前临时配制；酶（Aspergillus sp.，EC 1.6.6.2）——可作为“Nitrat”硝酸盐测定试剂盒购得；氢氧化钠约1 mol/l |
职业健康与安全
- 显色试剂中的37 %盐酸——通风橱、护目镜、手套
- N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐与亚硝酸钠——避免扬尘与皮肤接触；亚硝酸钠吞咽有毒
- 沸水浴与用热提取液均质——注意防止烫伤
- 卡雷兹试剂含亚铁氰化物——废液不得酸化（有释放氰化氢的风险）
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN 12014-3:2006 — 《Foodstuffs — Determination of nitrate and/or nitrite content — Part 3: Spectrometric determination of nitrate and nitrite content of meat products after enzymatic reduction of nitrate to nitrite》。
该方法的原理是什么？
取10 g（准确至10 mg）均质试样（温度低于25 °C；孔径 ≤ 4.5 mm的绞肉机，绞两遍），与约50 ml水均质30～60 s，用50 ml热水冲洗，用约1 mol/l的NaOH溶液将pH调至8.
测量范围和准确度是多少？
验证范围：亚硝酸盐9～22 mg/kg（NaNO2）与硝酸盐23～48 mg/kg（NaNO3）；以NaNO2计总量5～125 mg/kg适用；试样量与萃取：10 g（准确至10 mg），50 ml水 + 50 ml热水，pH 8.0～8.5，沸水浴15 min，200 ml容量瓶；澄清：各4 ml卡雷兹1号与2号溶液；折叠滤纸，弃去最初20 ml滤液；显色反应：2.0 ml溶液 + 1.0 ml水 + 3.0 ml试剂混合液，避光30 min，540 nm以水为参比。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 46 分钟。整个程序共 9 个步骤。
需要哪些设备？
均质机、水浴、pH计、分光光度计、折叠滤纸、200 ml与500 ml容量瓶、移液管、试管。
该检测用于哪些场景？
灌肠制品、罐头与熟食制品中亚硝酸盐与硝酸盐（E249～E252）含量的控制；肉制品中添加剂限量的官方监督；腌制过程与灌肠制品成熟过程中硝酸盐转化的研究；QAFP质量体系肉类罐头的检验方法；无镉方法——减少有毒废物的实验室中替代镉还原法的方案。
需要采取哪些安全防护措施？
显色试剂中的37 %盐酸——通风橱、护目镜、手套；N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐与亚硝酸钠——避免扬尘与皮肤接触；亚硝酸钠吞咽有毒；沸水浴与用热提取液均质——注意防止烫伤；卡雷兹试剂含亚铁氰化物——废液不得酸化（有释放氰化氢的风险）。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN 12014-3。