🍎 农产食品中的总氮与蛋白质——凯氏定氮法（消化、蒸馏、滴定）
三句话速览
试样在含催化剂（硒、铜）与硫酸钾的浓硫酸中消化，碱化后将氨蒸馏入硼酸并用标准酸滴定；氮以系数6。该检测依据 PN-A-04018:1975 (+Az3:2002)；试样量：含约0.02 g氮——通常0.5～1.5 g产品。整个程序共 8 个步骤（合计约 10 分钟）；主要用于：测定肉与肉制品、乳、谷物、饲料及其他农产食品中的总蛋白质、营养声称（蛋白质 = N × 系数）与规格符合性控制、间接分析仪（近红外、红外光谱）校准的参考方法。
要点速览
- 标准: PN-A-04018:1975 (+Az3:2002)
- 类别: 食品化学
- 操作步骤数: 8
- 各步骤合计时间: 10 分钟
- 试样量: 含约0.02 g氮——通常0.5～1.5 g产品
- 消化: 浓H2SO4（例如消化管中5 cm³）与催化剂Se或CuSO4以及K2SO4；380～410 °C；终点：溶液澄清或呈深褐色（格但斯克工业大学）
- 碱化与蒸馏: 约20 cm³ 30 % NaOH（格但斯克工业大学）或50 cm³ 33 % NaOH（弗罗茨瓦夫自然科学大学）；水蒸气蒸馏至约100 cm³馏出液
概述
凯氏定氮法自1883年问世以来变化不大，是测定食品中氮含量最常用的参考方法。该方法包括：用浓硫酸对产品进行“湿法”消化，将溶液碱化，蒸馏并定量测定生成的氨。以此测得的是总氮，其中除蛋白质氮外还包括蛋白质分解产物与其他有机化合物中的氮（铵离子、酰胺基、氨基、亚氨基）；亚硝酸盐与硝酸盐中的氮以及芳香杂环中的氮则不被测定。PN-A-04018:1975及其Az3:2002修改单被关于肉类组成的科研论文引用（蛋白质 = N × 6.25，Büchi装置），也见于省卫生防疫站（WSSE）的方法目录；其文本未能查阅——本说明依据格但斯克工业大学与格但斯克大学的实验指导书编写，采用前应与标准核对。
蛋白质中氮的平均含量约为16 %，因此所谓粗蛋白采用系数6.25（100∶16）；由于各类产品的蛋白质含氮量不同，故采用专用系数：鸡蛋蛋白6.67，乳6.38，肉6.25，黑麦、小麦与燕麦5.70——系数应与结果一并给出（例如乳为N × 6.38）。只有当产品不含或仅含极少量其他含氮化合物时，才可采用间接方法。取样量应使试样含约0.02 g氮（通常约0.5～1.5 g产品）。
该方法原理已用于自动化装置（消化仪、蒸馏单元或蒸馏与自动滴定单元），可实现每日一百次以上的分析。
方法原理
消化：在凯氏烧瓶或消化管中，有机化合物在浓硫酸中于催化剂（硫酸铜(II)、硫酸汞(II)、硒或硒-铜混合物）存在下被氧化，常另加提高硫酸沸点的硫酸钾或硫酸钠，必要时加入氧化剂（过氧化氢）；氮转化为硫酸铵（在格但斯克工业大学指导书中为硫酸氢铵，消化温度380～410 °C，消化完成的试样呈深褐色）。蒸馏：加入强碱溶液（30～33 % NaOH）后，释放出的氨随水蒸气蒸馏入盛有过量硼酸的接收瓶（25 cm³饱和溶液，含甲基红 + 溴甲酚绿混合指示剂），在其中结合为硼酸铵盐；或蒸入量取的0.1 N硫酸中，其过量部分用NaOH回滴。滴定：用标准盐酸（例如0.01 M）或硫酸溶液滴定所结合的氨，至指示剂恢复吸收氨之前的颜色。计算：%N = 14·V·c·100/(1000·m)（V为酸的体积，cm³；c为浓度，mol/dm³；m为干试样质量，g），蛋白质 = %N × 系数。
应用领域
- 测定肉与肉制品、乳、谷物、饲料及其他农产食品中的总蛋白质
- 营养声称（蛋白质 = N × 系数）与规格符合性控制
- 间接分析仪（近红外、红外光谱）校准的参考方法
- 科研中原料的基本化学组成（蛋白质 N × 6.25）
- 食品分析与分析化学实验课（氮的元素分析）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 试样量 | 含约0.02 g氮——通常0.5～1.5 g产品 |
| 消化 | 浓H2SO4（例如消化管中5 cm³）与催化剂Se或CuSO4以及K2SO4；380～410 °C；终点：溶液澄清或呈深褐色（格但斯克工业大学） |
| 碱化与蒸馏 | 约20 cm³ 30 % NaOH（格但斯克工业大学）或50 cm³ 33 % NaOH（弗罗茨瓦夫自然科学大学）；水蒸气蒸馏至约100 cm³馏出液 |
| 接收液 | 25 cm³含指示剂（甲基红 + 溴甲酚绿）的饱和硼酸，或25 cm³含Tashiro指示剂的0.1 N H2SO4 |
| 滴定 | 0.01 M HCl（格但斯克工业大学）或用0.1 N NaOH回滴过量酸（弗罗茨瓦夫）；1 cm³ 0.1 M HCl相当于0.0014 g N |
| 系数 | 粗蛋白6.25；蛋6.67；乳6.38；肉6.25；黑麦、小麦、燕麦5.70 |
标准
- 标准编号
- PN-A-04018:1975 (+Az3:2002)
- 标准名称（波兰语）
- Produkty rolniczo-żywnościowe — Oznaczanie azotu metodą Kjeldahla i przeliczanie na białko
- 标准名称（英语）
- Agricultural food products — Determination of nitrogen by the Kjeldahl method and conversion to protein (working translation)
分步操作程序
-
称样
向消化管中称取含约0.02 g氮的试样（通常0.5～1.5 g）；对于干燥产品应同时测定水分，以便换算为干物质。
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消化
加入催化剂（Se或CuSO4与K2SO4）与5 cm³浓硫酸；将消化管放入消化炉，封闭空余孔位，装上与水泵相连的抽吸罩并加热（温控器置于满功率）。约10 min后检查试样是否已消化完全；结束后取出带抽吸罩的消化管并冷却约10 min，然后用约10 cm³水冲洗管壁。
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蒸馏装置检查
注满水与碱液贮罐，打开冷却水，放入空管与接收瓶，蒸馏约100 cm³水（冲洗），关闭蒸汽。
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蒸馏
放入装有试样的消化管与盛有25 cm³含指示剂饱和硼酸的接收瓶；加入约20 cm³ 30 % NaOH碱液，开启蒸汽并蒸馏至收集约100 cm³馏出液；用水冲洗冷凝管末端。
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滴定
用0.01 M盐酸滴定接收瓶中的溶液，至指示剂恢复吸收氨之前的颜色（可借助对照溶液）。在接收瓶盛硫酸的变体中——用0.1 N NaOH回滴未结合的酸，至Tashiro指示剂呈绿色。
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对照试验
用全部试剂但不加试样做空白试验，并在计算中扣除。
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计算
%N = 14·V·c·100/(1000·m)（V为酸的体积，cm³；c为浓度，mol/dm³；m为干试样质量，g；1 cm³ 0.1 M HCl相当于0.0014 g N）；回滴变体中 %N = (M1 − M2)·n·0.014·100/m。蛋白质 = %N × 系数（通用6.25；乳6.38；谷物5.70；蛋6.67）。给出由重复测定得到的不确定度（RSD，k = 2）。
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检验报告
给出氮与蛋白质含量及所用系数、试样质量、催化剂以及方法变体（手动/自动）。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 带消化管的加热块式消化炉 | 带温控的加热工位、连接水泵的蒸气抽吸罩；也可使用以本生灯加热的250 cm³凯氏烧瓶 | — |
| 水蒸气蒸馏装置 | 水与碱液贮罐、NaOH加液装置、冷凝管；经典的Kjeldahl-Parnas装置带分馏头 | — |
| 自动化装置 | 例如Büchi 322型——自动消化、蒸馏与滴定 | — |
| 滴定管与200～250 cm³锥形瓶 | 用于滴定馏出液；另备指示剂颜色的对照溶液 | — |
| 分析天平 | 用于称取试样；烘箱用于测定试样的干物质 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 浓硫酸 | 7664-93-9 | 消化：消化管中5 cm³（格但斯克工业大学）；250 cm³烧瓶中5 + 30 cm³（弗罗茨瓦夫，土壤） |
| 催化剂：硒或硫酸铜(II) | 7782-49-2 | 硒混合物0.2 g或CuSO4 1.0 g（五水合物CAS 7758-99-8）；也可用硫酸汞(II)——因毒性而避免使用 |
| 硫酸钾 | 7778-80-5 | 1.0 g——提高硫酸的沸点 |
| 氢氧化钠30～33 % | 1310-73-2 | 蒸馏前碱化已消化的试样（每1 dm³含330 g） |
| 硼酸，含指示剂的饱和溶液 | 10043-35-3 | 氨的接收液；混合指示剂为甲基红 + 溴甲酚绿（或Tashiro指示剂：甲基红 + 亚甲基蓝） |
| 标准盐酸0.01～0.1 M | — | 滴定剂；也可在接收瓶中使用0.1 N H2SO4（每1 dm³含2.8 cm³浓硫酸）并用0.1 N NaOH回滴 |
职业健康与安全
- 380～410 °C下的浓硫酸——消化只能在带蒸气抽吸的通风橱内进行（SO2、酸雾），须佩戴护目镜、实验服与耐酸手套
- 作为催化剂的硒与铜/汞化合物有毒——称量时戴手套，废物按化学废物处置
- 30～33 %浓NaOH与高温水蒸气蒸馏——有灼伤与喷溅风险；碱液应自动加入，不得在有蒸汽压力时打开装置
- 盐酸与硼酸——采用常规防护措施
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-A-04018:1975 (+Az3:2002) — 《Agricultural food products — Determination of nitrogen by the Kjeldahl method and conversion to protein (working translation)》。
该方法的原理是什么？
消化：在凯氏烧瓶或消化管中，有机化合物在浓硫酸中于催化剂（硫酸铜(II)、硫酸汞(II)、硒或硒-铜混合物）存在下被氧化，常另加提高硫酸沸点的硫酸钾或硫酸钠，必要时加入氧化剂（过氧化氢）；氮转化为硫酸铵（在格但斯克工业大学指导书中为硫酸氢铵，消化温度380～410 °C，消化完成的试样呈深褐色）。蒸馏：加入强碱溶液（30～33 % NaOH）后，释放出的氨随水蒸气蒸馏入盛有过量硼酸的接收瓶（25 cm³饱和溶液，含甲基红 + 溴甲酚绿混合指示剂），在其中结合为硼酸铵盐；或蒸入量取的0.
测量范围和准确度是多少？
试样量：含约0.02 g氮——通常0.5～1.5 g产品；消化：浓H2SO4（例如消化管中5 cm³）与催化剂Se或CuSO4以及K2SO4；380～410 °C；终点：溶液澄清或呈深褐色（格但斯克工业大学）；碱化与蒸馏：约20 cm³ 30 % NaOH（格但斯克工业大学）或50 cm³ 33 % NaOH（弗罗茨瓦夫自然科学大学）；水蒸气蒸馏至约100 cm³馏出液；接收液：25 cm³含指示剂（甲基红 + 溴甲酚绿）的饱和硼酸，或25 cm³含Tashiro指示剂的0.1 N H2SO4。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 10 分钟。整个程序共 8 个步骤。
需要哪些设备？
带消化管的加热块式消化炉、水蒸气蒸馏装置、自动化装置、滴定管与200～250 cm³锥形瓶、分析天平。
该检测用于哪些场景？
测定肉与肉制品、乳、谷物、饲料及其他农产食品中的总蛋白质；营养声称（蛋白质 = N × 系数）与规格符合性控制；间接分析仪（近红外、红外光谱）校准的参考方法；科研中原料的基本化学组成（蛋白质 N × 6.25）；食品分析与分析化学实验课（氮的元素分析）。
需要采取哪些安全防护措施？
380～410 °C下的浓硫酸——消化只能在带蒸气抽吸的通风橱内进行（SO2、酸雾），须佩戴护目镜、实验服与耐酸手套；作为催化剂的硒与铜/汞化合物有毒——称量时戴手套，废物按化学废物处置；30～33 %浓NaOH与高温水蒸气蒸馏——有灼伤与喷溅风险；碱液应自动加入，不得在有蒸汽压力时打开装置；盐酸与硼酸——采用常规防护措施。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-A-04018。