⚗️ 水中亚硝酸盐氮和硝酸盐氮——流动分析（CFA/FIA），配镉还原与Griess反应（磺胺、N-(1-萘基)乙二胺，520–560 nm）

理化 PN-EN ISO 13395

概述

ISO 13395:1996规定了用流动分析法——连续流动（CFA）和流动注射（FIA）——配分光检测测定水中亚硝酸盐氮、硝酸盐氮及二者之和的自动化程序。工作范围：亚硝酸盐(N)——范围II 0.01–0.1 mg/l，范围I 0.1–1.0 mg/l；亚硝酸盐/硝酸盐(N)——范围II 0.2–2 mg/l，范围I 2–20 mg/l；每个范围都需要单独校准（至少5个标准）。亚硝酸盐的化学反应与手工方法（ISO 6777）相同。2019年的条例（Dz.U. 2019 poz. 1311［2019年《法律公报》第1311项］）把PN-EN ISO 13395（流动分析CFA和FIA配分光检测）列为废水中亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的参比方法。在波兰它以PN-EN ISO 13395:2001（波兰语版）施行。

一般干扰：亚硝酸盐无法稳定保存——须立即分析；大于0.1 mm的颗粒会堵塞管路（膜过滤），较小的可通过渗析除去；干扰性有机基体（大摩尔质量的化合物）可用管路内渗析或活性炭过滤除去（前提是不改变浓度）；样品自身的吸收通过不加试剂的测量加以补偿；盐度超过30 g/l的样品应稀释。硝酸盐的还原要求与缓冲液混合后pH为6.5–7.5（强酸性、强碱性或有缓冲能力的样品在测量前先校正）；表面活性剂超过10 mg/l会干扰染料的生成（渗析）。含镉的液态或固态废物须妥善处置。在手工实践中（PWr教材《Chemia wody》），亚硝酸盐用对氨基苯磺酸和α-萘胺在540 nm处比色测定（0.001–0.1 mg/dm³），或按PN-EN 26777用4-氨基苯磺酰胺（即磺胺）和N-(1-萘基)-1,2-二氨基乙烷二盐酸盐在磷酸中测定（pH 1.9，540 nm），硝酸盐——与酚二磺酸共同蒸干后测定（410 nm）。

方法原理

样品连续与缓冲溶液混合（咪唑0.25 mol/l——17.0 g/l，用HCl调至pH 7.5；也可用氯化铵85 g/l、pH约7.5——并加硫酸铜2.5 g/l：每100 ml加100 µl，新配制）；样品中的硝酸盐被金属镉还原为亚硝酸盐；随后连续混入含磷酸的试剂（5 g磺胺（对氨基苯磺酰胺）和0.5 g N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐 + 50 ml 1.71 g/ml的H₃PO₄，配成500 ml；在棕色瓶中至少稳定1周；H₃PO₄也可用HCl代替）——原有的和还原生成的亚硝酸盐在酸性介质中把磺胺重氮化为重氮盐，后者与N-(1-萘基)乙二胺偶联生成红色染料。测定亚硝酸盐(N)时绕过镉还原；硝酸盐(N)由总和 − 亚硝酸盐求得。还原柱：0.3–1.5 mm的镉颗粒（FIA中如4.0 mm × 不少于5 cm的柱）或镉管（CFA中内径1.1 mm）——还原效率须不低于90 %，每批测定前通过比较相同N浓度（2或20 mg/l）的硝酸盐溶液和亚硝酸盐溶液的信号进行检查；颗粒的制备：用1 mol/l HCl搅拌至呈金属光泽，冲洗，用20 g/l CuSO₄搅拌2 min共两次（表面变黑），冲洗，无气泡装柱，用硝酸盐溶液活化三次；镉管：5 ml缓冲的CuSO₄（5 min，两次），20 ml咪唑溶液；柱在咪唑溶液中无气泡保存。溶液：亚硝酸盐(N) 100 mg/l（492.6 mg NaNO₂在150 °C下干燥后定容至1000 ml；在4 °C下2周）、20 mg/l和1 mg/l的溶液（新配制）；硝酸盐(N) 200 mg/l（144.4 mg KNO₃定容至100 ml；1个月）和20 mg/l（新配制）；校准标准按表2和表3（如取1–10 ml的1 mg/l溶液定容至100 ml得NO₂-N 0.01–0.10 mg/l；取1–10 ml的20 mg/l溶液定容至100 ml得NO₃-N 0.2–2.0 mg/l），在测量前临时配制；聚乙二醇十二烷基醚表面活性剂30 %（载流液中1 ml/l，约4周）；载流液和缓冲液C与B须脱气（用于FIA）。FIA仪器：试剂储液瓶、低脉动泵、10–300 µl定量环、镉还原柱、惰性塑料的0.5–0.8 mm管路和盘管、可选的纤维素膜渗析池（在定量环之后；供体与受体流量相同）、520–560 nm带流通池的光度检测器、记录仪（以峰高评价）、自动进样器；CFA：自动进样器、泵、镉管、气泡分隔的流路（推荐氮气；用空气时须在镉柱前脱气）、渗析、520–560 nm的检测器。系统检查：低范围内0.05 mg/l NO₂-N或1 mg/l NO₃-N的标准应给出每10 mm不低于0.04的吸光度。试剂空白：用水代替缓冲液B和试剂R1通入2 min——吸光度变化超过0.015/10 mm说明水或试剂被污染。样品：仅测亚硝酸盐——玻璃瓶或聚乙烯瓶，立即分析；测总和或亚硝酸盐含量低时测硝酸盐——同样用PE/PTFE，用HCl酸化至约pH 2，2–5 °C，24 h内分析（特殊情况下经验证后可在−20 °C下保存至多8天）；颗粒大于0.1 mm时过滤。

应用领域

• 处理后和未处理的废水——亚硝酸盐氮和硝酸盐氮（按Dz.U. 2019 poz. 1311为参比方法），硝化／反硝化的控制
• 地表水和地下水——农业硝酸盐的监测（范围至20 mg/l N）
• 饮用水——亚硝酸盐从0.01 mg/l N起以及硝酸盐
• 通量大的实验室——带自动进样器的FIA/CFA自动流动分析
• 有色、浑浊或含表面活性剂的样品——管路内渗析；含盐水（超过30 g/l）稀释后测定

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 13395:2001 (ISO 13395:1996)

标准名称（波兰语）

Jakość wody — Oznaczanie azotu azotynowego i azotanowego oraz ich sumy metodą analizy przepływowej (CFA i FIA) z detekcją spektrometryczną

标准名称（英语）

Water quality — Determination of nitrite nitrogen and nitrate nitrogen and the sum of both by flow analysis (CFA and FIA) and spectrometric detection

分步操作程序

1. 样品

   把容器用水洗净并用样品润洗。亚硝酸盐应立即测定（玻璃瓶或聚乙烯瓶）。测总和或（亚硝酸盐含量低时）测硝酸盐时用HCl酸化至约pH 2，在2–5 °C下保存并在24 h内分析（特殊情况下经验证后可在−20 °C下保存至多8天）；颗粒大于0.1 mm时过滤；盐度超过30 g/l时稀释；把强酸性／强碱性样品的pH调节到加缓冲液后为6.5–7.5。

2. 镉还原柱

   颗粒：用1 mol/l HCl搅拌至呈金属光泽，用水冲洗，用20 g/l CuSO₄搅拌2 min共两次（变黑），冲洗，无气泡装柱（玻璃棉），装好后用硝酸盐溶液活化三次，并测量该范围的最高标准（2或20 mg/l）直至结果稳定。管：2 × 5 ml缓冲的CuSO₄（各5 min），20 ml咪唑。在咪唑中无气泡保存。

3. 还原效率的检查

   每批测定前依次测量相同浓度的硝酸盐(N)溶液和亚硝酸盐(N)溶液（范围II用2 mg/l，范围I用20 mg/l）；若硝酸盐信号低于亚硝酸盐信号的90 %——重新制备／活化还原柱。

4. 系统准备与空白

   搭建系统（FIA/CFA；测总和时接还原柱，测亚硝酸盐时不接），通入试剂约10 min（测总和时：不接还原柱10 min、接还原柱10 min），把基线调零并检查信噪比；用0.05 mg/l NO₂-N或1 mg/l NO₃-N的标准检查系统（A ≥ 0.04/10 mm）；做试剂空白（用水代替B和R1通入2 min；变化超过0.015 A → 更换水／试剂）。

5. 校准

   选定工作范围并在测量前临时配制至少5个标准（表2–3：如取1–10 ml的1 mg/l NO₂-N溶液定容至100 ml → 0.01–0.10 mg/l；取1–10 ml的20 mg/l NO₃-N溶液定容至100 ml → 0.2–2.0 mg/l）；在与样品相同的条件下测量标准和空白；每个范围和每种形态单独校准。

6. 测量与结果

   测量样品（峰高）；有色样品还应测量不加试剂时的信号并扣除；由校准函数计算NO₂-N和NO₂+NO₃-N，NO₃-N取差值；结果以mg/l N表示（按教材，换算为离子的系数：N-NO₃ × 4.4267 = NO₃⁻，N-NO₂ × 3.2882 = NO₂⁻）。含镉废物按法规处置。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 镉及其废物（溶液、用过的颗粒）有毒且致癌——单独收集并按法规处置
• N-(1-萘基)乙二胺和磺胺——避免接触皮肤；磷酸和盐酸——护目镜、手套
• 咪唑——刺激性；硫酸铜——对水生环境有害
• 分隔用氮气钢瓶——固定牢靠，房间通风

常见问题