🥜 食品过敏原（ELISA）
用有证试剂盒以酶联免疫吸附法（ELISA）定量测定食品中的过敏原（麸质、乳、蛋、花生、大豆等）。
要点速览
- 标准: AOAC 2012.01 / AOAC 2014.03 / AOAC 991.19 (seria metod ELISA)
- 类别: 食品化学
- 操作步骤数: 11
- 各步骤合计时间: 1 小时 40 分钟–2 小时 30 分钟
- 检出限（LOD）: 过敏原 1–5 mg/kg（ppm）
- 测定范围: 5–200 mg/kg（典型校准曲线范围）
- 分析时间: 30–90 min（视试剂盒 — 快速型或标准型）
概述
食品过敏原测定是食品安全的关键环节 —（EU）1169/2011 号法规要求在食品标签上声明 14 类主要过敏原。ELISA（酶联免疫吸附试验）法是定量测定食品和接触表面中过敏原蛋白应用最广的实验室技术。
方法原理基于抗原—抗体的特异性结合。有两种主要形式：夹心 ELISA — 检出具有两个表位的完整蛋白和大片段；竞争 ELISA — 也可检出小蛋白片段，这对经强热加工的食品至关重要。
最常用的商品化试剂盒有：RIDASCREEN（R-Biopharm）、Veratox 和 Reveal（Neogen）、AgraQuant（Romer Labs）和 ELISA Systems。这些试剂盒具有 AOAC-OMA（官方分析方法）确认，并为国际食品法典委员会所推荐。常测过敏原包括：麸质（小麦、黑麦、大麦醇溶蛋白）、乳蛋白（酪蛋白、β-乳球蛋白）、蛋蛋白（卵清蛋白、卵类黏蛋白）、花生蛋白（Ara h1、Ara h2），以及大豆、坚果、芝麻和芥末蛋白。
ELISA 的检出限通常为产品中 1–5 mg/kg（ppm）过敏原，可用于评估是否符合安全阈值。开展此类检验的实验室参加 PT 计划（FAPAS、LGC）并按 ISO 17025 获得认可。
方法原理
夹心 ELISA 中：微孔板孔内包被针对某过敏原的特异性抗体。将食品样品提取液在孔中孵育 — 过敏原与抗体结合。洗涤后加入酶标（HRP 或 AP）第二抗体，其与过敏原的另一表位结合（形成"夹心"）。再次洗涤后加入酶底物 — 生成有色产物，其强度（吸光度）与过敏原浓度成正比。在酶标仪上于 450 nm 读数。
应用领域
- 无麸质生产质量控制（按食品法典限值 < 20 mg/kg）
- 生产线清洗效果验证（涂抹样）— 防止交叉污染
- 原料和半成品中未声明过敏原的检验
- 卫生监督部门对进口食品的控制
- 产品召回背景下的食品检验
- 食品企业清洗程序确认
- 婴幼儿食品分析（过敏原管理最严格）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 检出限（LOD） | 过敏原 1–5 mg/kg（ppm） |
| 测定范围 | 5–200 mg/kg（典型校准曲线范围） |
| 分析时间 | 30–90 min（视试剂盒 — 快速型或标准型） |
| 形式 | 96 孔微孔板（12 条 × 8 孔） |
| 读数波长 | 450 nm（参比 620–650 nm） |
| 食品法典麸质限值 | < 20 mg/kg 醇溶蛋白（= 麸质 < 20 ppm） |
标准
- 标准编号
- AOAC 2012.01 / AOAC 2014.03 / AOAC 991.19 (seria metod ELISA)
- 标准名称（波兰语）
- Oznaczanie alergenów pokarmowych metodą immunoenzymatyczną ELISA
- 标准名称（英语）
- Determination of food allergens by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
分步操作程序
-
样品制备
将食品样品均质至质地均一。称取 1 g 于提取管中。
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提取
加入试剂盒提取缓冲液 10 mL。室温振摇/混合 10 min（麸质用 Mendez 混合液时为 60°C）。
-
离心与稀释
2500 × g 离心 10 min。取上清液。按试剂盒说明稀释（通常 1:10 或 1:100）。
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加样至微孔板
将 100 µL 校准标准液（5 个浓度 + 零点）、样品和对照分别加入相应孔中。均做双孔。
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孵育 I
微孔板在室温孵育 30 min（快速型试剂盒为 10 min）。轻微振荡。
-
洗板
用 300 µL 洗涤液洗 3 次。倒扣并在吸水纸上拍干残液。
-
加酶标物孵育
加入 100 µL 抗体-酶结合物。室温孵育 30 min。
-
洗板 II
按第 6 步洗 3 次。
-
显色
加入 100 µL 酶底物（TMB）。避光孵育 15 min。加入 100 µL 终止液。
-
读取吸光度
在酶标仪上于 450 nm（参比 620 nm）测定吸光度。须在终止后 30 min 内完成。
-
结果计算
绘制校准曲线（吸光度对浓度）。读取样品中过敏原浓度。换算为产品中的 mg/kg。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 酶标仪 | Tecan Sunrise、BioTek ELx800、Thermo Multiskan FC | 15 000–50 000 PLN |
| 孵育器（37°C 或室温） | 微孔板振荡孵育器、Heidolph Titramax 1000 | 3 000–8 000 PLN |
| 洗板机 | BioTek ELx50、Tecan HydroFlex、Thermo Wellwash | 15 000–40 000 PLN |
| 均质机 | IKA Ultra-Turrax T25、Stomacher 400 | 5 000–15 000 PLN |
| 多道移液器 | Eppendorf Research Plus 8 道（10–100 µL、100–1200 µL） | 2 000–5 000 PLN |
| 分析天平 | Mettler Toledo MS105DU、RADWAG AS 220.R2 | 8 000–20 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 麸质 ELISA 试剂盒（RIDASCREEN Gliadin） | — | R-Biopharm R7001 — 醇溶蛋白测定用夹心 ELISA，AOAC-OMA 证书，96 测试，约 2 500 PLN |
| 乳 ELISA 试剂盒（RIDASCREEN FAST Milk） | — | R-Biopharm R4652 — 快速型 30 min，LOD 0,7 mg/kg，48 测试 |
| 蛋 ELISA 试剂盒（Neogen Veratox Egg） | — | Neogen 8470 — 夹心 ELISA，LOD 2,5 mg/kg，48 测试 |
| 花生 ELISA 试剂盒（RIDASCREEN FAST Peanut） | — | R-Biopharm R6802 — LOD 0,1 mg/kg，经 AOAC-OMA 确认 |
| 大豆 ELISA 试剂盒（AgraQuant Soy） | — | Romer Labs — 大豆蛋白竞争 ELISA，96 测试 |
| 提取缓冲液 | — | 试剂盒内配备或按制造商说明配制（如麸质用 Mendez 混合液） |
职业健康与安全
- 终止液（H₂SO₄）— 腐蚀性，须戴护目镜和手套
- 提取缓冲液 — 可能含巯基乙醇（有毒）— 须在通风柜中操作
- TMB 底物 — 疑有致突变作用，须戴手套
- 生物材料（含过敏原的食品样品）— 对致敏人员有反应风险
- 微孔板废物 — 按实验室废物处置
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 AOAC 2012.01 / AOAC 2014.03 / AOAC 991.19 (seria metod ELISA) — 《Determination of food allergens by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)》。
该方法的原理是什么？
夹心 ELISA 中：微孔板孔内包被针对某过敏原的特异性抗体。将食品样品提取液在孔中孵育 — 过敏原与抗体结合。
测量范围和准确度是多少？
检出限（LOD）：过敏原 1–5 mg/kg（ppm）；测定范围：5–200 mg/kg（典型校准曲线范围）；分析时间：30–90 min（视试剂盒 — 快速型或标准型）；形式：96 孔微孔板（12 条 × 8 孔）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 1 小时 40 分钟–2 小时 30 分钟。整个程序共 11 个步骤。
需要哪些设备？
酶标仪、孵育器（37°C 或室温）、洗板机、均质机、多道移液器、分析天平。核心仪器的参考价格（酶标仪）：15 000–50 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
无麸质生产质量控制（按食品法典限值 < 20 mg/kg）；生产线清洗效果验证（涂抹样）— 防止交叉污染；原料和半成品中未声明过敏原的检验；卫生监督部门对进口食品的控制；产品召回背景下的食品检验；食品企业清洗程序确认；婴幼儿食品分析（过敏原管理最严格）。
需要采取哪些安全防护措施？
终止液（H₂SO₄）— 腐蚀性，须戴护目镜和手套；提取缓冲液 — 可能含巯基乙醇（有毒）— 须在通风柜中操作；TMB 底物 — 疑有致突变作用，须戴手套；生物材料（含过敏原的食品样品）— 对致敏人员有反应风险；微孔板废物 — 按实验室废物处置。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 AOAC 2012.01 (seria)。