🍎 Vitamin C — HPLC
Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C) in Lebensmitteln mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit UV-Detektion. Wichtiger Nährwertparameter.
Übersicht
Vitamin C (L-Ascorbinsäure) ist ein essentieller Nährstoff, Antioxidans und einer der am häufigsten deklarierten Bestandteile auf Lebensmitteletiketten. Methode PN-EN 14130 ist die chromatographische Referenzmethode (HPLC-UV) zur Bestimmung der Summe von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure (nach DTT-Reduktion) in Lebensmitteln.
Die Methode umfasst die Extraktion von Vitamin C aus der Probe mit Metaphosphorsäure (Stabilisator), Reduktion der oxidierten Form (DHAA) mit Dithiothreitol (DTT), Trennung an C18-Säule mit gepufferter mobiler Phase und UV-Detektion bei 245 nm. Messbereich: 1–1000 mg/100 g.
Prinzip der Methode
Die Probe wird mit Metaphosphorsäure (HPO₃)-Lösung homogenisiert, um die Oxidation von Vitamin C zu verhindern. Nach Zentrifugation wird der Überstand mit DTT (Dithiothreitol) behandelt, um DHAA zu Ascorbinsäure zu reduzieren. Die Lösung wird filtriert (0,22 µm) und mittels HPLC an C18-Säule mit mobiler Phase: 50 mmol/L KH₂PO₄, pH 2,5 analysiert. UV-Detektion bei 245 nm. Quantitative Bestimmung über Kalibrierkurve (L-Ascorbinsäure, CRM).
Anwendungen
- Lebensmittelkennzeichnungskontrolle — Vitamin-C-Deklaration (EU-VO 1169/2011)
- Analyse von Obst- und Gemüsesäften
- Analyse von angereicherten Lebensmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln
- Qualitätskontrolle von Säuglingsnahrung
- Stabilitätsprüfung — Vitamin-C-Abbau im Laufe der Zeit
- Analyse von frischem und gefrorenem Obst und Gemüse
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Messbereich | 1–1000 mg/100 g |
| Nachweisgrenze | 0,5 mg/100 g |
| Detektionswellenlänge | 245 nm |
| Präzision (CV) | 2–5% |
| Analysezeit | 10–15 min/Probe |
Norm
- Normnummer
- PN-EN 14130:2004
- Titel (PL)
- Artykuły żywnościowe — Oznaczanie witaminy C metodą HPLC
- Title (EN)
- Foodstuffs — Determination of vitamin C by HPLC
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Extraktion
Probe 5–10 g einwiegen. 50 mL 3% HPO₃ zugeben. 2 min homogenisieren. Bei 10 000 g / 10 min zentrifugieren.
2. DHAA-Reduktion
Zu 5 mL Überstand 1 mL DTT (40 mg/mL) geben. 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Filtration
Durch 0,22 µm PVDF-Filter in HPLC-Vial filtrieren.
4. Kalibrierung
Ascorbinsäure-Standards vorbereiten: 5, 10, 25, 50, 100 mg/L in 3% HPO₃.
5. HPLC-Analyse
C18-Säule, mobile Phase: 50 mM KH₂PO₄ pH 2,5 + 2% MeOH, Fluss 1 mL/min, Detektion 245 nm.
6. Berechnungen
Konzentration aus Kalibrierkurve ablesen. In mg/100 g Probe umrechnen. Verdünnung berücksichtigen.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| HPLC-System mit UV/DAD-Detektor | Agilent 1260 Infinity II, Shimadzu Nexera, Waters Alliance | 200 000–400 000 PLN |
| C18-Säule | Waters Atlantis T3 150×4,6 mm, 5 µm | 2 000–4 000 PLN |
| Autosampler | In HPLC-System integriert | integriert |
| Laborzentrifuge | Eppendorf 5804R, Hettich Rotina 380R | 10 000–30 000 PLN |
| Homogenisator | IKA Ultra-Turrax T25, Kinematica PT 3100 | 5 000–15 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| L-Ascorbinsäure (Standard) | 50-81-7 | Reinheit ≥99%, zertifiziertes CRM zur Kalibrierung |
| Metaphosphorsäure HPO₃ | 37267-86-0 | 3–5% Lösung, Vitamin-C-Stabilisator, verhindert Oxidation |
| Dithiothreitol (DTT) | 3483-12-3 | Reduktionsmittel DHAA → Ascorbinsäure, 40 mg/mL Lösung |
| Kaliumdihydrogenphosphat KH₂PO₄ | 7778-77-0 | Mobile Phase: 50 mmol/L, pH 2,5 (mit H₃PO₄ angesäuert) |
| Methanol HPLC grade | 67-56-1 | Mobiler-Phase-Zusatz (2–5%) |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Metaphosphorsäure — reizend, Handschuhe und Schutzbrille erforderlich
- Methanol — giftig, entzündlich. Arbeit im Abzug.
- DTT — reizend, unangenehmer Geruch. Arbeit unter Absaugung.
- HPLC-Abfall — getrennt sammeln (organischer Abfall)