🦠 Vibrio spp. in Lebensmitteln
Kurz gefasst
Nachweis potenziell enteropathogener Vibrio spp. (V. Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 21872-1:2017; Anreicherung I: 41,5°C/6 h und/oder 37°C/6 h in ASPW. Das Verfahren umfasst 8 Schritte (insgesamt rund 4 Tage 35 Min.–5 Tage 35 Min.); eingesetzt wird sie unter anderem für: Meeresfrüchte-Qualitätskontrolle — Muscheln, Austern, Miesmuscheln, Garnelen, Fisch- und Fischproduktuntersuchung, besonders roh (Sushi, Sashimi), Überwachung von Meeres- und Ästuarwasser in Muschelgewinnungsgebieten.
Auf einen Blick
- Norm: PN-EN ISO 21872-1:2017
- Kategorie: Mikrobiologie
- Verfahrensschritte: 8
- Gesamtdauer der Schritte: 4 Tage 35 Min.–5 Tage 35 Min.
- Anreicherung I: 41,5°C/6 h und/oder 37°C/6 h in ASPW
- Anreicherung II: 41,5°C/18 h oder 37°C/18 h in frischem ASPW
- Isolierung: 37°C/24 h auf TCBS Agar
Übersicht
Vibrio ist eine Gattung gramnegativer, halophiler (salzliebender) Bakterien, die natürlicherweise in Meeres- und Ästuargewässern vorkommen. Drei hauptsächliche enteropathogene Arten sind: V. parahaemolyticus — häufigste Ursache bakterieller Lebensmittelvergiftungen im Zusammenhang mit Meeresfrüchten (Durchfall, Krämpfe, Fieber, 12–24 h nach Verzehr); V. cholerae — Cholera-Erreger (O1- und O139-Stämme) und mildere Gastroenteritis (Nicht-O1/Nicht-O139-Stämme); V. vulnificus — gefährlichste Art, verursacht Sepsis mit >50% Sterblichkeit bei Personen mit Lebererkrankungen.
Die Norm PN-EN ISO 21872-1 beschreibt ein horizontales Verfahren zum Nachweis dieser drei Vibrio-Arten in Lebensmitteln (hauptsächlich Meeresfrüchte: Muscheln, Austern, Garnelen, Fische) und Umweltproben. Die Methode umfasst selektive Anreicherung in alkalischem Salzpepton-Wasser (ASPW — Alkaline Saline Peptone Water), Isolierung auf TCBS-Agar (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar) und zweitem selektiven Medium sowie biochemische und/oder molekulare (PCR) Bestätigung.
ASPW bietet alkalische (pH 8,6) und salzige (NaCl 2–3%) Bedingungen, die das Vibrio-Wachstum begünstigen, während viele andere Bakterien gehemmt werden. TCBS-Agar ist hochselektives Medium — Gallensalze und Saccharose differenzieren Vibrio-Arten: V. parahaemolyticus (grün-blaue Kolonien, saccharose-negativ), V. cholerae (gelbe Kolonien, saccharose-positiv), V. vulnificus (grüne Kolonien, saccharose-negativ).
Die Vibrio-Untersuchung gewinnt aufgrund der Klimaerwärmung an Bedeutung — Vibrio breiten sich auf neue Gewässer aus (Ostsee, Nordsee). In der EU ist die Untersuchung im Rahmen der amtlichen Kontrolle von Meeresfrüchten und Muscheln vorgeschrieben.
Prinzip der Methode
Die Probe wird in zwei aufeinanderfolgenden Portionen ASPW (Alkaline Saline Peptone Water, pH 8,6, NaCl 2–3%) angereichert. Erste Anreicherungsstufe: 41,5°C/6 h und/oder 37°C/6 h. Zweite Stufe: Transfer in frisches ASPW, 41,5°C/18 h (V. parahaemolyticus, V. cholerae) oder 37°C/18 h (V. vulnificus). Hoher pH-Wert und Salzgehalt von ASPW fördern selektiv Vibrio-Wachstum. Nach Anreicherung Aussaat auf TCBS-Agar (37°C/24 h) und zweites Medium. Auf TCBS bildet V. parahaemolyticus grün-blaue Kolonien (Saccharose −), V. cholerae — gelbe (Saccharose +), V. vulnificus — grüne (Saccharose −). Bestätigung: biochemische Tests (Oxidase +, Wachstum mit NaCl, Voges-Proskauer-Reaktion) und/oder PCR (Toxingene: tdh, trh für V. parahaemolyticus; ctx für V. cholerae).
Anwendungen
- Meeresfrüchte-Qualitätskontrolle — Muscheln, Austern, Miesmuscheln, Garnelen
- Fisch- und Fischproduktuntersuchung, besonders roh (Sushi, Sashimi)
- Überwachung von Meeres- und Ästuarwasser in Muschelgewinnungsgebieten
- Amtliche Kontrolle importierter Meeresfrüchte
- Epidemiologische Untersuchung bei Ausbrüchen nach Meeresfrüchteverzehr
- Klimaüberwachung — Verfolgung der Vibrio-Ausbreitung auf neue Gewässer (Ostsee)
- Salat- und Gerichte mit Meeresfrüchten-Untersuchung (verzehrfertig)
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Anreicherung I | 41,5°C/6 h und/oder 37°C/6 h in ASPW |
| Anreicherung II | 41,5°C/18 h oder 37°C/18 h in frischem ASPW |
| Isolierung | 37°C/24 h auf TCBS Agar |
| Isolierungsmedium | TCBS Agar (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) |
| Kolonietyp | V. parahaemolyticus: grün-blau; V. cholerae: gelb; V. vulnificus: grün |
| Bestätigung | Oxidase (+), biochemische Tests und/oder PCR (tdh, trh, ctx) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 21872-1:2017
- Titel (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania Vibrio spp. — Część 1: Wykrywanie potencjalnie enteropatogennych Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae i Vibrio vulnificus
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of Vibrio spp. — Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus
Schritt-für-Schritt-Verfahren
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Probenvorbereitung
Wiegen Sie 25 g Probe (Meeresfrüchte) in einen Stomacher-Beutel. Fügen Sie 225 mL ASPW (pH 8,6) hinzu. Homogenisieren Sie für 60–120 s.
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Anreicherung — Stufe I
Inkubieren Sie bei 41,5 ± 1°C für 6 h (V. parahaemolyticus, V. cholerae). Parallel können Sie zweite Portion bei 37 ± 1°C für 6 h inkubieren (V. vulnificus).
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Anreicherung — Stufe II
Übertragen Sie 1 mL aus angereicherter Kultur in 10 mL frisches ASPW. Inkubieren Sie 41,5°C/18 h (V. parahaemolyticus, V. cholerae) oder 37°C/18 h (V. vulnificus).
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Isolierung auf TCBS
Streichen Sie aus angereicherter Bouillon auf TCBS-Agarplatte und zweites selektives Medium (z.B. chromogen) aus. Inkubieren Sie 37 ± 1°C für 24 ± 2 h. HINWEIS: TCBS-Agar NICHT autoklavieren — durch Kochen lösen und auf Platten gießen.
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Kolonieablesung auf TCBS
Suchen Sie nach typischen Kolonien: V. parahaemolyticus — grün-blau, 2–3 mm; V. cholerae — gelb, glatt, 2–3 mm; V. vulnificus — grün, 1–2 mm.
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Subkultur auf nicht-selektivem Medium
Wählen Sie min. 3–5 typische Kolonien von jeder Platte. Subkultur auf Agar mit NaCl (TSA + 1% NaCl). Inkubieren Sie 37°C/24 h.
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Bestätigungstests
Führen Sie durch: Oxidase-Test (+), Wachstumstest mit verschiedenen NaCl-Konzentrationen (0%, 3%, 6%, 8%, 10%), Saccharose-Fermentationstest, Voges-Proskauer-Reaktion, String-Test. Oder bestätigen Sie per PCR (Gene: tlh/tdh/trh für V. parahaemolyticus; ctx/ompW für V. cholerae; vvhA für V. vulnificus).
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Berichterstattung
Ergebnis: "V. parahaemolyticus / V. cholerae / V. vulnificus nachgewiesen/nicht nachgewiesen in 25 g". Geben Sie Art und Virulenzfaktorenprofil an (wenn PCR durchgeführt).
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Laborinkubator 37°C und 41,5°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5.000–18.000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank Klasse II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC2 | 25.000–60.000 PLN |
| Stomacher / Homogenisator | Seward Stomacher 400 Circulator | 12.000–25.000 PLN |
| Labor-pH-Meter | Mettler Toledo SevenEasy, WTW inoLab pH 7310 | 3.000–10.000 PLN |
| Laborautoklav | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15.000–45.000 PLN |
| PCR-Thermocycler (für molekulare Bestätigung) | Bio-Rad CFX96, Applied Biosystems 7500 | 40.000–120.000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| ASPW (Alkaline Saline Peptone Water) | — | Pepton, NaCl 20–30 g/L, pH 8,6 ± 0,2; für selektive Vibrio-Anreicherung; 500 g Packung |
| TCBS Agar (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) | — | Hochselektives Medium: Natriumthiosulfat, Natriumcitrat, Gallensalze, Saccharose, Agar; 500 g Packung. Nicht autoklavieren — nur lösen und gießen! |
| Saccharose | 57-50-1 | TCBS-Komponente — differenziert Vibrio-Arten (Fermentation → gelbe Kolonien) |
| Natriumthiosulfat | 7772-98-7 | TCBS-Komponente — Indikator für H₂S-Produktion |
| Gallensalze (Ox Bile) | — | Selektives Agens in TCBS zur Hemmung grampositiver Bakterien; 8 g/L |
| Natriumchlorid (NaCl) | 7647-14-5 | ASPW- und Medien-Komponente — Vibrio benötigt NaCl für Wachstum (halophil); 20–30 g/L |
| Oxidase-Reagenz | — | Für Bestätigungstest — Vibrio oxidase-positiv; Streifen oder Tropfen |
| PCR-Kits (tdh, trh, ctx) | — | Zur molekularen Bestätigung von Virulenzfaktoren; optional |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- V. cholerae — BSL-2-Erreger (Nicht-O1/Nicht-O139-Stämme) oder BSL-3 (O1/O139), biologische Sicherheitsrichtlinien befolgen
- V. vulnificus — >50% Sterblichkeit bei Personen mit Lebererkrankungen, besondere Vorsicht bei Schnittverletzungen
- Arbeit ausschließlich in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II
- Gallensalze in TCBS — reizend, Handschuhe und Schutzbrille verwenden
- Gebrauchte Materialien vor Entsorgung autoklavieren (121°C/20 min)
- Oberflächendesinfektion mit 70% Ethanol — Vibrio empfindlich gegenüber Austrocknung
Häufige Fragen
Welche Norm beschreibt diese Prüfung?
Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 21872-1:2017 — „Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of Vibrio spp. — Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus“.
Wie funktioniert diese Methode?
Die Probe wird in zwei aufeinanderfolgenden Portionen ASPW (Alkaline Saline Peptone Water, pH 8,6, NaCl 2–3%) angereichert. Erste Anreicherungsstufe: 41,5°C/6 h und/oder 37°C/6 h.
Wie groß sind Messbereich und Genauigkeit?
Anreicherung I: 41,5°C/6 h und/oder 37°C/6 h in ASPW; Anreicherung II: 41,5°C/18 h oder 37°C/18 h in frischem ASPW; Isolierung: 37°C/24 h auf TCBS Agar; Isolierungsmedium: TCBS Agar (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose).
Wie lange dauert die Prüfung?
Die für die einzelnen Schritte angegebenen Zeiten ergeben zusammen rund 4 Tage 35 Min.–5 Tage 35 Min. Das Verfahren umfasst 8 Schritte.
Welche Geräte werden benötigt?
Laborinkubator 37°C und 41,5°C, Laminar-Flow-Werkbank Klasse II, Stomacher / Homogenisator, Labor-pH-Meter, Laborautoklav, PCR-Thermocycler (für molekulare Bestätigung). Richtpreis für das Kerngerät (Laborinkubator 37°C und 41,5°C): 5.000–18.000 PLN.
Wo wird diese Prüfung eingesetzt?
Meeresfrüchte-Qualitätskontrolle — Muscheln, Austern, Miesmuscheln, Garnelen; Fisch- und Fischproduktuntersuchung, besonders roh (Sushi, Sashimi); Überwachung von Meeres- und Ästuarwasser in Muschelgewinnungsgebieten; Amtliche Kontrolle importierter Meeresfrüchte; Epidemiologische Untersuchung bei Ausbrüchen nach Meeresfrüchteverzehr; Klimaüberwachung — Verfolgung der Vibrio-Ausbreitung auf neue Gewässer (Ostsee); Salat- und Gerichte mit Meeresfrüchten-Untersuchung (verzehrfertig).
Welche Sicherheitsmaßnahmen gelten?
V. cholerae — BSL-2-Erreger (Nicht-O1/Nicht-O139-Stämme) oder BSL-3 (O1/O139), biologische Sicherheitsrichtlinien befolgen; V. vulnificus — >50% Sterblichkeit bei Personen mit Lebererkrankungen, besondere Vorsicht bei Schnittverletzungen; Arbeit ausschließlich in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II; Gallensalze in TCBS — reizend, Handschuhe und Schutzbrille verwenden; Gebrauchte Materialien vor Entsorgung autoklavieren (121°C/20 min); Oberflächendesinfektion mit 70% Ethanol — Vibrio empfindlich gegenüber Austrocknung.
Welches Labor führt diese Prüfung durch?
Die Prüfung führen nach ISO/IEC 17025 akkreditierte Labore durch. Auf LabCoda finden Sie sie über die Normnummer PN-EN ISO 21872-1.