🦠 Trichinella-Larven im Fleisch — Verfahren der künstlichen Verdauung mit Magnetrührer

Mikrobiologie PN-EN ISO 18743

Übersicht

ISO 18743:2015 legt ein Verfahren zum Nachweis von Trichinella-Larven im Fleisch durch künstliche Verdauung unter Verwendung eines Magnetrührers fest. Die Proben müssen frei von Fett, Sehnen und Faszien sein (von der Zunge wird die harte Bindegewebsschicht entfernt); die Größe der Einzelprobe legt die zuständige Behörde fest, Proben einzelner Tiere dürfen zusammengefasst werden — die höchste Muskelmasse im Pool für die Verdauung beträgt 100 g, erforderlichenfalls zusätzlich bis zu 15 g; bei einem kleineren Pool (z. B. 50 g) dürfen Volumen und Zusammensetzung der Flüssigkeit proportional bis auf mindestens 1 l verringert werden. Die Proben sind den Prädilektionsmuskeln zu entnehmen (beim Schwein — Zwerchfellpfeiler oder Kaumuskel; beim Pferd — Kaumuskel, Zwerchfell, Zunge; beim Wildschwein — Zwerchfell, Vordergliedmaße, Zunge), und zwar in der doppelten Masse der für die Untersuchung benötigten; sie sind möglichst rasch zu untersuchen oder bei 2–8 °C aufzubewahren, nicht einzufrieren. Gefrorene Proben (z. B. aus der Überwachung von Wildtieren) werden mit einer auf bis zu 60 min verlängerten Sedimentationszeit untersucht, weil sich abgestorbene Larven aus der Spiralform strecken und langsamer absinken; die Einwaage ist dann zu erhöhen. Das Ergebnis wird als Nachweis oder Nichtnachweis von Trichinella-Larven in x Gramm der Probe angegeben; alle verdächtigen Funde werden bei 60–100facher Vergrößerung betrachtet, und positive Larven sollten zur mikroskopischen und molekularen Identifizierung (PCR) bis zur Art bzw. zum Genotyp weitergegeben werden.

In der Europäischen Union benennt die Durchführungsverordnung (EU) 2015/1375 (in der Fassung nach der Änderung 2022/1418) in Anhang I Kapitel I die Norm ISO 18743:2015 als Referenzverfahren für den Nachweis von Trichinen und beschreibt in Kapitel II gleichwertige Verfahren (z. B. die Verdauung im Homogenisator Stomacher 3500 mit anderthalb Litern Wasser von 40–41 °C, 25 ml 17,5 % HCl und 6 g Pepsin über 25 min; Sieb 180 µm mit einem Durchmesser von 11 cm; Thermometer mit 0,5 °C im Bereich 20–70 °C; Waage ± 0,1 g). Das Pepsin muss eine Stärke von 1:10 000 NF haben (entspricht 1:12 500 BP und 2 000 FIP) oder in flüssiger Form mindestens 660 E/ml; eine andere Aktivität ist zulässig, wenn die Endaktivität der Flüssigkeit 10 g Pepsin 1:10 000 NF entspricht (Abschnitt 5.3 der ISO 18743). Die Leitlinien der Kommission für Audits der Trichinen-Laboratorien prüfen unter anderem die Anwendung des Verfahrens mit Magnetrührer, die Maschenweite der Siebe von 180 µm, die Qualität von Pepsin und Säure sowie die Sedimentationszeiten. In Polen gilt die Norm als PN-EN ISO 18743:2015-11 mit der Änderung A1:2024-02.

Prinzip der Methode

Das Fleisch wird im Mixer/Fleischwolf unter Zugabe von 50–100 ml Verdauungsflüssigkeit oder Leitungswasser (45 ± 2 °C) je 100 g zerkleinert — üblicherweise mit drei Impulsen von 5–10 s, nicht länger, um die Larven nicht zu beschädigen. Die Verdauungsflüssigkeit wird frisch angesetzt: Zu 2 l auf 45 ± 2 °C erwärmtem Leitungswasser werden 16 ml 25%ige Salzsäure gegeben (bei 37 % HCl — 11 ml), das Rühren wird eingeschaltet und danach werden 10 g Pepsin als Pulver/Granulat (1:10 000 NF) oder 30 ml flüssiges Pepsin (660 E/ml) zugegeben; die Reihenfolge Wasser → Säure → Pepsin ist zwingend, weil sie das Pepsin vor der Zersetzung durch die konzentrierte Säure schützt. Das zerkleinerte Fleisch wird in ein 3-l-Becherglas mit der Flüssigkeit überführt (die Geräte werden mit der Flüssigkeit gespült), das Becherglas wird mit Aluminiumfolie abgedeckt, und es wird 30 min bei 45 ± 2 °C verdaut, wobei so gerührt wird, dass ein tiefer Wirbel ohne Spritzen entsteht; die Zeit darf auf höchstens 60 min verlängert werden. Die Flüssigkeit wird durch ein Sieb von 180–200 µm in einen Scheidetrichter gegossen (Becherglas und Sieb werden mit ≥ 100 ml Wasser gespült); die Verdauung gilt als zufriedenstellend, wenn auf dem Sieb überwiegend unverdauliches Gewebe (Faszien, Bindegewebe) in einer Menge von nicht mehr als 5 % der Probenmasse zurückbleibt — andernfalls wird das Verfahren wiederholt. Nach 30 min Sedimentation wird der Hahn des Scheidetrichters rasch und vollständig geöffnet und es werden etwa 40 ml (primäres Sediment) in ein Röhrchen abgelassen, 10 min stehen gelassen, 30 ml des Überstandes abgesaugt und ≤ 10 ml (sekundäres Sediment) belassen, die zusammen mit 10 ml Spülflüssigkeit in eine Petrischale mit Rasterboden gegossen werden; nach mindestens 1 min wird die Durchsichtigkeit geprüft (Schärfe der Rasterlinien) und systematisch, Feld für Feld, unter dem Stereomikroskop oder dem Trichinoskop bei 10–20facher Vergrößerung mindestens 10 min lang durchgemustert; ein trübes Sediment wird durch erneutes Verdünnen auf 40 ml, 10 min Sedimentation und Absaugen auf 10 ml geklärt. Die Untersuchung wird unmittelbar nach der Verdauung durchgeführt (spätestens am selben Tag, die Schale im Kühlschrank); gefundene Larven werden in ein Fläschchen von 1–2 ml mit 70–90 % Ethanol überführt.

Anwendungen

• Amtliche Untersuchung des Fleisches von Schweinen, Pferden und Wildschweinen auf Trichinen in Schlachthöfen und Zerlegebetrieben (Referenzverfahren nach der Verordnung (EU) 2015/1375)
• Untersuchung von Sammelproben bis 100 g (z. B. 100 Proben zu je 1 g) mit der Möglichkeit, über die Verdauung immer kleinerer Pools bis zum Ursprungsschlachtkörper zurückzugehen
• Überwachung von Wildtieren (Füchse, Marderhunde, Bären) — auch gefrorener Proben mit verlängerter Sedimentation
• Veterinär- und amtliche Laboratorien, die Audits nach den Leitlinien der Europäischen Kommission unterliegen
• Qualitätsdokumentation: Laborblatt (Chargennummer des Pepsins, Verdauungszeit, Rückstände auf dem Sieb, Ergebnis)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 18743:2015-11 + A1:2024-02 (ISO 18743:2015 + Amd 1:2023)

Titel (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Wykrywanie larw włośni Trichinella w mięsie metodą wytrawiania

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme und Probenvorbereitung

   Entnimm die Prädilektionsmuskeln (Schwein: Zwerchfellpfeiler oder Kaumuskel) in der doppelten Masse der für die Untersuchung benötigten; entferne Fett, Sehnen und Faszien. Prüfe Masse, Zustand und Kennzeichnung; untersuche sofort oder bewahre bei 2–8 °C ohne Einfrieren auf. Pool für die Verdauung: höchstens 100 g (+ bis 15 g).

2. Zerkleinerung

   Zerkleinere das Fleisch im Mixer/Fleischwolf mit 50–100 ml Verdauungsflüssigkeit oder Wasser von 45 ± 2 °C je 100 g, üblicherweise mit drei Impulsen von 5–10 s — nicht länger, um die Larven nicht zu beschädigen.

3. Verdauungsflüssigkeit (frisch)

   Gib zu 2 l Leitungswasser von 45 ± 2 °C im Becherglas 16 ml 25 % HCl (11 ml bei 37 %), schalte das Rühren auf dem Magnetrührer ein und gib 10 g Pepsin 1:10 000 NF oder 30 ml flüssiges Pepsin 660 E/ml zu. Reihenfolge: Wasser, Säure, Pepsin.

4. Verdauung

   Überführe das Fleisch in das 3-l-Becherglas mit der Flüssigkeit, spüle den Mixer mit der Flüssigkeit aus, decke mit Folie ab, halte 45 ± 2 °C (mit dem Thermometer kontrollieren) und rühre so, dass ein tiefer Wirbel ohne Spritzen entsteht. Verdaue 30 min; verlängere erforderlichenfalls auf insgesamt höchstens 60 min.

5. Filtration

   Gieße die Flüssigkeit bei geschlossenem Hahn durch das Sieb von 180–200 µm in den Scheidetrichter; spüle Becherglas und Sieb mit ≥ 100 ml Wasser. Sind auf dem Sieb mehr als 5 % der Probenmasse oder unverdaute Muskeln zurückgeblieben — wiederhole die Verdauung (verdaue den Rest nach und untersuche ihn zusätzlich oder entnimm neue Proben).

6. Sedimentation und Abnahme des Sediments

   Sedimentiere 30 min (der Trichter darf alle 10 min sanft beklopft werden; gefrorene Proben — bis 60 min). Öffne den Hahn rasch und vollständig, lasse etwa 40 ml des primären Sediments in ein Röhrchen ab, stelle es 10 min beiseite, sauge 30 ml des Überstandes ab und belasse ≤ 10 ml sekundäres Sediment (bei Trübung: gib 30 ml Wasser zu, 10 min, wiederhole).

7. Mikroskopische Untersuchung

   Gieße das sekundäre Sediment in eine Petrischale mit Rasterboden, spüle das Röhrchen mit 10 ml Wasser nach, warte ≥ 1 min. Prüfe die Durchsichtigkeit (Schärfe des Rasters); kläre erforderlichenfalls (auf 40 ml auffüllen, 10 min, auf 10 ml absaugen). Mustere Feld für Feld bei 10–20× mindestens 10 min lang durch, ohne die Flüssigkeit zu bewegen; verdächtige Objekte bei 60–100×. Untersuche sofort, spätestens am selben Tag (die Schale im Kühlschrank).

8. Ergebnis und Umgang mit positiven Befunden

   Gib den Nachweis/Nichtnachweis von Trichinella-Larven in x g an. Überführe die Larven in ein Fläschchen von 1–2 ml mit 70–90 % Ethanol und gib sie zur Identifizierung weiter (Mikroskopie, PCR). Bei einem positiven Pool verdaue immer kleinere Pools größerer Proben, bis der Schlachtkörper bestimmt ist. Fülle das Laborblatt aus (Pepsin — Chargennummer, Verdauungszeit, Rückstände auf dem Sieb, Ergebnis).

9. Dekontamination

   Dekontaminiere Flüssigkeiten, Spülflüssigkeiten, Glas und Geräte, die Larven enthalten können, vor dem Verwerfen oder Spülen durch Erhitzen auf ≥ 70 °C oder chemisch (z. B. Natriumhypochlorit mit 0,01 % aktivem Chlor über ≥ 3 h).

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Trichinella-Larven sind für den Menschen infektiös — Dekontamination aller Flüssigkeiten und Geräte (≥ 70 °C oder Hypochlorit), Handschuhe, kein Essen im Labor
• Konzentrierte Salzsäure (25–37 %) — Schutzbrille, Handschuhe, Abzug beim Abmessen; die Säure immer in das Wasser geben
• Pepsin als Pulver — das Einatmen vermeiden (Allergien); das Pepsin nach der Säure zugeben, niemals in die konzentrierte Säure
• Heiße Flüssigkeit von 45 °C und Rührer mit Heizplatte — Vorsicht beim Umgießen in den Scheidetrichter
• Glas großen Fassungsvermögens (Bechergläser 3 l, Scheidetrichter 2,5 l) — Gefahr des Bruchs und des Verschüttens von infektiösem Material

Häufige Fragen