🧬 STEC/VTEC — Verotoxigene E. coli
Kurz gefasst
Nachweis von Shiga-Toxin-produzierenden Escherichia coli (STEC/VTEC) in Lebensmitteln mittels Real-time-PCR-Methode — Detektion von Virulenzgenen (stx1, stx2, eae) und Bestimmung von Serogruppen O157, O111, O26, O103, O145. Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO/TS 13136:2013; Anreicherung: 37 ± 1°C, 18–24 h in BPW oder mTSB + Novobiocin. Das Verfahren umfasst 8 Schritte (insgesamt rund 1 Tage 23 Std. 40 Min.–2 Tage 6 Std. 10 Min.); eingesetzt wird sie unter anderem für: Sprossen- und Keimsaatenkontrolle — Verordnung (EG) 2073/2005, Rinderhackfleischuntersuchung (gehackt, Steaks, Burger), Unpasteurisierte Milch- und Rohmilchkäsekontrolle.
Auf einen Blick
- Norm: PN-EN ISO/TS 13136:2013
- Kategorie: Mikrobiologie
- Verfahrensschritte: 8
- Gesamtdauer der Schritte: 1 Tage 23 Std. 40 Min.–2 Tage 6 Std. 10 Min.
- Anreicherung: 37 ± 1°C, 18–24 h in BPW oder mTSB + Novobiocin
- Nachweismethode: Real-time-PCR (qPCR) mit TaqMan-Sonden
- Virulenzgene: stx1, stx2 (Shiga-Toxine), eae (Intimin)
Übersicht
STEC (Shiga toxin-producing Escherichia coli), auch bekannt als VTEC (Verocytotoxin-producing E. coli), sind pathogene E. coli-Stämme, die Shiga-Toxine (Stx1 und/oder Stx2) produzieren — zu den gefährlichsten lebensmittelbedingten Krankheitserregern gehörend. STEC-Infektion kann zu hämorrhagischer Kolitis (blutiger Durchfall) und hämolytisch-urämischem Syndrom (HUS) mit Nierenversagen, Thrombozytopenie und hämolytischer Anämie führen. Die HUS-Sterblichkeit beträgt 3–5%, und bleibende Nierenschäden treten bei 25% der Kinder mit HUS auf.
Die gefährlichsten Serogruppen (sogenannte "Top 5" oder "Big 6") sind: O157 (am häufigsten, am besten bekannt), O26, O111, O103 und O145. Infektionsquelle ist meist Rindfleisch (roh oder unzureichend gegart), unpasteurisierte Milch, rohe Sprossen (Luzerne, Brokkoli), Salat und Wasser. Die infektiöse Dosis ist extrem niedrig — nur 10–100 Zellen reichen aus.
Die Norm PN-EN ISO/TS 13136 beschreibt eine molekulare STEC-Nachweismethode basierend auf Real-time-PCR. Dies ist die einzige normierte PCR-Methode für STEC in Lebensmitteln. Die Methode umfasst: Probenanreicherung (18–24 h), DNA-Extraktion, Virulenzgen-Detektion (stx1, stx2 — Shiga-Toxin-Gene; eae — Intimin-Gen, Adhäsionsprotein) und Serogruppen-Bestimmung (O157, O111, O26, O103, O145) mittels Real-time-PCR.
Wenn stx- und eae-Gene und "Top 5"-Serotyp nachgewiesen werden — ist Stammisolierung erforderlich, oft unter Verwendung immunmagnetischer Separation (IMS). Die Untersuchung ist in der EU für Sprossen und Keimsaaten obligatorisch (Verordnung (EG) 2073/2005) und Rinderhackfleisch in einigen Ländern. Die STEC O104:H4-Epidemiekrise in Deutschland 2011 (Bockshornklee-Sprossen, >4000 Fälle, 54 Todesfälle) verstärkte die Untersuchungsanforderungen erheblich.
Prinzip der Methode
Dreistufige Methode: (1) Anreicherung — Probe wird in Anreicherungsbouillon (z.B. BPW oder mTSB mit Novobiocin) bei 37°C/18–24 h inkubiert. (2) DNA-Extraktion — DNA wird aus angereicherter Kultur isoliert (Thermolyse oder Extraktionskits). (3) Real-time-PCR — Real-time-PCR-Reaktionen mit Fluoreszenzsonden (TaqMan) werden durchgeführt zur Detektion: stx1- und stx2-Gene (Shiga-Toxine), eae-Gen (Intimin — Adhäsion an Enterozyten) und Serogruppenogene (wzgA-O157, wzx-O111, wzx-O26, wzx-O103, wzx-O145). Wenn Probe positiv für stx + eae + "Top 5"-Serogruppe ist — wird STEC-Stamm isoliert, oft unter Verwendung von IMS (immunmagnetische Separation) mit Anti-O-Antikörper-beschichteten Beads.
Anwendungen
- Sprossen- und Keimsaatenkontrolle — Verordnung (EG) 2073/2005
- Rinderhackfleischuntersuchung (gehackt, Steaks, Burger)
- Unpasteurisierte Milch- und Rohmilchkäsekontrolle
- Salat-, Blattgemüse- und Obstuntersuchung (verzehrfertig)
- Epidemiologische Untersuchung bei HUS/hämorrhagische Kolitis-Ausbrüchen
- Trinkwasser- und Freizeitwasser-Überwachung
- Importierte Lebensmittelkontrolle (besonders aus Ländern mit hoher Endemizität)
- Untersuchungen im Rahmen von Lebensmittelsicherheits-Kontrollprogrammen (RASFF)
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Anreicherung | 37 ± 1°C, 18–24 h in BPW oder mTSB + Novobiocin |
| Nachweismethode | Real-time-PCR (qPCR) mit TaqMan-Sonden |
| Virulenzgene | stx1, stx2 (Shiga-Toxine), eae (Intimin) |
| Serogruppen | O157, O111, O26, O103, O145 |
| Isolierung (optional) | IMS (immunmagnetische Separation) + Aussaat auf CT-SMAC / chromogen |
| Empfindlichkeit | 1–10 KBE/25 g (nach Anreicherung) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO/TS 13136:2013
- Titel (PL)
- Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) oraz oznaczania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145
- Title (EN)
- Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
Schritt-für-Schritt-Verfahren
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Probenvorbereitung und Anreicherung
Wiegen Sie 25 g Probe, fügen Sie 225 mL Anreicherungsbouillon (BPW oder mTSB mit Novobiocin) hinzu. Homogenisieren Sie im Stomacher. Inkubieren Sie 37 ± 1°C für 18–24 h.
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DNA-Extraktion
Entnehmen Sie 1 mL angereicherte Kultur. Extrahieren Sie DNA mit Extraktionskit (Silica-Säulen, magnetische Beads oder Thermolyse: 100°C/10 min). Messen Sie DNA-Konzentration und Reinheit (optional).
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PCR-Screening — Virulenzgene
Bereiten Sie 3 PCR-Reaktionen vor (Simplex oder Multiplex): stx1, stx2, eae. Fügen Sie DNA, Primer, TaqMan-Sonden, Master Mix hinzu. Programm: 95°C/10 min → 40 Zyklen (95°C/15 s, 60°C/60 s). Analysieren Sie Fluoreszenzkurven — Ct < 35 = positives Ergebnis.
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PCR-Screening — Serogruppen (wenn stx+)
Wenn stx1 und/oder stx2 nachgewiesen — bereiten Sie 5 PCR-Reaktionen für Serogruppen vor: O157, O111, O26, O103, O145. Gleiches Temperaturprogramm. Positives Ergebnis = Ct < 35.
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Screening-Interpretation
Varianten: (A) stx+ / eae+ / Top5-Serogruppe+ → potenziell positive Probe, Stammisolierung erforderlich. (B) stx+ / eae− oder Serogruppe negativ → STEC vorhanden, aber nicht Top5, berichten. (C) stx− → negative Probe.
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Stammisolierung (IMS)
Für Variante (A): Fügen Sie 20 µL immunmagnetische Beads (Anti-O entsprechender Serogruppe) zu 1 mL angereicherter Kultur hinzu. Inkubieren Sie 15–30 min mit Mischen. Trennen Sie auf Magnet. Waschen Sie 3x. Säen Sie auf CT-SMAC (O157) oder chromogenem Agar aus.
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Isolat-Bestätigung
Von CT-SMAC/chromogener Platte wählen Sie typische Kolonien (O157: Sorbitol-, farblos). Bestätigen Sie per PCR — Isolat muss stx1/stx2 + eae + entsprechendes Serogruppengen besitzen. Optional: Latexagglutination (Anti-O157, etc.).
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Berichterstattung
Screening-Ergebnis: "STEC (stx+) nachgewiesen/nicht nachgewiesen in 25 g". Wenn Stamm isoliert: "STEC O157:H7 (stx2+, eae+) isoliert aus 25 g Probe". Positives Ergebnis in Lebensmitteln = RASFF-Benachrichtigung.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Real-time-PCR-Thermocycler | Bio-Rad CFX96 Touch, Applied Biosystems 7500 Fast, Roche LightCycler 480 | 60.000–180.000 PLN |
| IMS-System (immunmagnetische Separation) | Dynabeads anti-E. coli O157 + Magnetseparator (Dynal MPC-S) | 5.000–15.000 PLN (Separator) + 2.000–4.000 PLN/Kit Beads |
| Laborzentrifuge | Eppendorf 5424 R, Hettich Mikro 200 R | 8.000–25.000 PLN |
| PCR-Kabine (Pre-PCR) | Biosan UVT-S-AR, ESCO PCR Cabinet | 5.000–15.000 PLN |
| DNA-Extraktionskit | Qiagen DNeasy Food Kit, Promega Wizard, PrepMan Ultra | 1.500–3.000 PLN / 50 Extraktionen |
| Inkubator 37°C | Binder BD 56, Memmert INB 200 | 5.000–18.000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank Klasse II | Thermo Scientific MSC-Advantage | 25.000–60.000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Real-time-PCR-Kits für STEC (stx1, stx2, eae) | — | Kits mit Primern, TaqMan-Sonden und Kontrollen: z.B. Bio-Rad iQ-Check STEC VirA, Romer RapidFinder STEC, Merck GeneDisc STEC; 96 Reaktionen Packung |
| PCR-Kits für Serogruppen (O157, O111, O26, O103, O145) | — | Separate oder Multiplex-Kits mit Primern/Sonden für wzx/wzy-Gene; 96 Reaktionen Packung |
| PCR Master Mix (Polymerase + dNTP + Puffer) | — | Z.B. Bio-Rad SsoAdvanced Universal Probes Supermix, TaqMan Universal Master Mix; 200 Reaktionen Packung |
| DNA-Extraktionskit | — | Silica-Säulen oder magnetische Beads; z.B. Qiagen DNeasy, Promega Wizard; 50 Extraktionen Packung |
| mTSB + Novobiocin (Anreicherungsbouillon) | — | Modifizierte Tryptic-Soja-Bouillon mit Novobiocin (20 mg/L) — selektive STEC-Anreicherung; 500 g Packung + Supplemente |
| Immunmagnetische Beads (IMS) | — | Dynabeads anti-E. coli O157, O26, O111, O103, O145; 5 mL Packung (50 Reaktionen) |
| CT-SMAC Agar (Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey) | — | Medium zur E. coli O157-Isolierung (Sorbitol-negativ); 500 g Packung + Supplemente |
| Gepuffertes Peptonwasser (BPW) | — | Alternative Anreicherungsbouillon, 500 g Packung |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- STEC — BSL-2-Erreger mit extrem niedriger infektiöser Dosis (10–100 Zellen!), höchste Vorsichtsmaßnahmen verwenden
- Arbeit mit Kulturen ausschließlich in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II
- Getrennte Pre-PCR- und Post-PCR-Zonen — Amplikon-Kontamination verhindern
- Novobiocin — Antibiotikum, Hautkontakt vermeiden
- Gebrauchte Materialien und Kulturen autoklavieren (121°C/30 min) vor Entsorgung
- Bei O157-Verdacht — Benachrichtigung des Referenzlabors erwägen
Häufige Fragen
Welche Norm beschreibt diese Prüfung?
Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO/TS 13136:2013 — „Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups“.
Wie funktioniert diese Methode?
Dreistufige Methode: (1) Anreicherung — Probe wird in Anreicherungsbouillon (z.B.
Wie groß sind Messbereich und Genauigkeit?
Anreicherung: 37 ± 1°C, 18–24 h in BPW oder mTSB + Novobiocin; Nachweismethode: Real-time-PCR (qPCR) mit TaqMan-Sonden; Virulenzgene: stx1, stx2 (Shiga-Toxine), eae (Intimin); Serogruppen: O157, O111, O26, O103, O145.
Wie lange dauert die Prüfung?
Die für die einzelnen Schritte angegebenen Zeiten ergeben zusammen rund 1 Tage 23 Std. 40 Min.–2 Tage 6 Std. 10 Min. Das Verfahren umfasst 8 Schritte.
Welche Geräte werden benötigt?
Real-time-PCR-Thermocycler, IMS-System (immunmagnetische Separation), Laborzentrifuge, PCR-Kabine (Pre-PCR), DNA-Extraktionskit, Inkubator 37°C, Laminar-Flow-Werkbank Klasse II. Richtpreis für das Kerngerät (Real-time-PCR-Thermocycler): 60.000–180.000 PLN.
Wo wird diese Prüfung eingesetzt?
Sprossen- und Keimsaatenkontrolle — Verordnung (EG) 2073/2005; Rinderhackfleischuntersuchung (gehackt, Steaks, Burger); Unpasteurisierte Milch- und Rohmilchkäsekontrolle; Salat-, Blattgemüse- und Obstuntersuchung (verzehrfertig); Epidemiologische Untersuchung bei HUS/hämorrhagische Kolitis-Ausbrüchen; Trinkwasser- und Freizeitwasser-Überwachung; Importierte Lebensmittelkontrolle (besonders aus Ländern mit hoher Endemizität); Untersuchungen im Rahmen von Lebensmittelsicherheits-Kontrollprogrammen (RASFF).
Welche Sicherheitsmaßnahmen gelten?
STEC — BSL-2-Erreger mit extrem niedriger infektiöser Dosis (10–100 Zellen!), höchste Vorsichtsmaßnahmen verwenden; Arbeit mit Kulturen ausschließlich in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II; Getrennte Pre-PCR- und Post-PCR-Zonen — Amplikon-Kontamination verhindern; Novobiocin — Antibiotikum, Hautkontakt vermeiden; Gebrauchte Materialien und Kulturen autoklavieren (121°C/30 min) vor Entsorgung; Bei O157-Verdacht — Benachrichtigung des Referenzlabors erwägen.
Welches Labor führt diese Prüfung durch?
Die Prüfung führen nach ISO/IEC 17025 akkreditierte Labore durch. Auf LabCoda finden Sie sie über die Normnummer PN-EN ISO 13136.