🧬 STEC/VTEC — Verotoxigene E. coli

Mikrobiologie ISO/TS 13136

Übersicht

STEC (Shiga toxin-producing Escherichia coli), auch bekannt als VTEC (Verocytotoxin-producing E. coli), sind pathogene E. coli-Stämme, die Shiga-Toxine (Stx1 und/oder Stx2) produzieren — zu den gefährlichsten lebensmittelbedingten Krankheitserregern gehörend. STEC-Infektion kann zu hämorrhagischer Kolitis (blutiger Durchfall) und hämolytisch-urämischem Syndrom (HUS) mit Nierenversagen, Thrombozytopenie und hämolytischer Anämie führen. Die HUS-Sterblichkeit beträgt 3–5%, und bleibende Nierenschäden treten bei 25% der Kinder mit HUS auf.

Die gefährlichsten Serogruppen (sogenannte "Top 5" oder "Big 6") sind: O157 (am häufigsten, am besten bekannt), O26, O111, O103 und O145. Infektionsquelle ist meist Rindfleisch (roh oder unzureichend gegart), unpasteurisierte Milch, rohe Sprossen (Luzerne, Brokkoli), Salat und Wasser. Die infektiöse Dosis ist extrem niedrig — nur 10–100 Zellen reichen aus.

Die Norm ISO/TS 13136 beschreibt eine molekulare STEC-Nachweismethode basierend auf Real-time-PCR. Dies ist die einzige normierte PCR-Methode für STEC in Lebensmitteln. Die Methode umfasst: Probenanreicherung (18–24 h), DNA-Extraktion, Virulenzgen-Detektion (stx1, stx2 — Shiga-Toxin-Gene; eae — Intimin-Gen, Adhäsionsprotein) und Serogruppen-Bestimmung (O157, O111, O26, O103, O145) mittels Real-time-PCR.

Wenn stx- und eae-Gene und "Top 5"-Serotyp nachgewiesen werden — ist Stammisolierung erforderlich, oft unter Verwendung immunmagnetischer Separation (IMS). Die Untersuchung ist in der EU für Sprossen und Keimsaaten obligatorisch (Verordnung (EG) 2073/2005) und Rinderhackfleisch in einigen Ländern. Die STEC O104:H4-Epidemiekrise in Deutschland 2011 (Bockshornklee-Sprossen, >4000 Fälle, 54 Todesfälle) verstärkte die Untersuchungsanforderungen erheblich.

DER SCHLÜSSEL KAM IN KEINEM UMFANG VOR — DER REITER ZEIGTE NULL BEI NEUN VORHANDENEN LABORATORIEN (23.09.2026). Das Schlüsselfeld hatte die Form „PN-EN ISO 13136", die Technische Spezifikation trägt in ihrer Bezeichnung jedoch das Glied „/TS" (ISO/TS), das im Schlüssel fehlte. Messung von vier Varianten (23.09, Kopie der Umfänge, Abgleich über den Anfang des Wertes): „PN-EN ISO 13136" 0 Positionen, „PN-EN ISO/TS 13136" 0, „PN-ISO 13136" 0, dagegen „ISO/TS 13136" — 12 POSITIONEN BEI 9 LABORATORIEN. Der Schlüssel wurde auf die letzte Form gesetzt; der Reiter zeigt jetzt neun Laboratorien statt keines. Der Fehler ergab sich aus dem Vergleich des Schlüssels mit der vollständigen Bezeichnung in demselben Eintrag: Die vollständige Bezeichnung lautete „PN-EN ISO/TS 13136:2013", und das Glied „/TS" WAR darin enthalten. Der Schlüssel war also keine Kurzform der vollständigen Bezeichnung, sondern ihre Entstellung — und das sieht man nicht, solange man jedes dieser Felder für sich betrachtet.

ZUSAMMENFÜHRUNG EINER DUBLETTE — DIESER EINTRAG HAT DIE QUELLEN DES ANDEREN ÜBERNOMMEN (23.09.2026). Dieselbe Technische Spezifikation hatte im Portal zwei Einträge: diesen und „STEC/Shigatoxin-bildende E. coli in Lebensmitteln — Real-time-PCR". Dasselbe Bezugsdokument, dasselbe Verfahren und derselbe Prüfgegenstand — eine Dublette, nicht zwei Darstellungen. Der andere Eintrag war kürzer (9324 Zeichen gegenüber 11 112), hatte aber einen Quellenabschnitt, der hier fehlte, DESHALB WAR DIE LÖSUNG DIE ZUSAMMENFÜHRUNG UND NICHT DIE AUSWAHL: Der längere Inhalt blieb unter der älteren Adresse, die Quellen wurden hierher übertragen und der andere Eintrag gelöscht. Festgehalten, weil die Länge allein hier irreführend wäre: Bei den früheren Zusammenführungen genügte die Regel „der reichhaltigere übernimmt die ältere Adresse", weil der reichhaltigere sowohl länger als auch besser belegt war. Hier zeigten diese beiden Maße auf verschiedene Einträge.

Prinzip der Methode

Dreistufige Methode: (1) Anreicherung — Probe wird in Anreicherungsbouillon (z.B. BPW oder mTSB mit Novobiocin) bei 37°C/18–24 h inkubiert. (2) DNA-Extraktion — DNA wird aus angereicherter Kultur isoliert (Thermolyse oder Extraktionskits). (3) Real-time-PCR — Real-time-PCR-Reaktionen mit Fluoreszenzsonden (TaqMan) werden durchgeführt zur Detektion: stx1- und stx2-Gene (Shiga-Toxine), eae-Gen (Intimin — Adhäsion an Enterozyten) und Serogruppenogene (wzgA-O157, wzx-O111, wzx-O26, wzx-O103, wzx-O145). Wenn Probe positiv für stx + eae + "Top 5"-Serogruppe ist — wird STEC-Stamm isoliert, oft unter Verwendung von IMS (immunmagnetische Separation) mit Anti-O-Antikörper-beschichteten Beads.

Anwendungen

• Sprossen- und Keimsaatenkontrolle — Verordnung (EG) 2073/2005
• Rinderhackfleischuntersuchung (gehackt, Steaks, Burger)
• Unpasteurisierte Milch- und Rohmilchkäsekontrolle
• Salat-, Blattgemüse- und Obstuntersuchung (verzehrfertig)
• Epidemiologische Untersuchung bei HUS/hämorrhagische Kolitis-Ausbrüchen
• Trinkwasser- und Freizeitwasser-Überwachung
• Importierte Lebensmittelkontrolle (besonders aus Ländern mit hoher Endemizität)
• Untersuchungen im Rahmen von Lebensmittelsicherheits-Kontrollprogrammen (RASFF)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO/TS 13136:2013

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) oraz oznaczania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145

Title (EN)

Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenvorbereitung und Anreicherung

   Wiegen Sie 25 g Probe, fügen Sie 225 mL Anreicherungsbouillon (BPW oder mTSB mit Novobiocin) hinzu. Homogenisieren Sie im Stomacher. Inkubieren Sie 37 ± 1°C für 18–24 h.

   ⏱ Zeit: 18–24 h • 🌡 Temperatur: 37°C

2. DNA-Extraktion

   Entnehmen Sie 1 mL angereicherte Kultur. Extrahieren Sie DNA mit Extraktionskit (Silica-Säulen, magnetische Beads oder Thermolyse: 100°C/10 min). Messen Sie DNA-Konzentration und Reinheit (optional).

   ⏱ Zeit: 30–60 min

3. PCR-Screening — Virulenzgene

   Bereiten Sie 3 PCR-Reaktionen vor (Simplex oder Multiplex): stx1, stx2, eae. Fügen Sie DNA, Primer, TaqMan-Sonden, Master Mix hinzu. Programm: 95°C/10 min → 40 Zyklen (95°C/15 s, 60°C/60 s). Analysieren Sie Fluoreszenzkurven — Ct < 35 = positives Ergebnis.

   ⏱ Zeit: 90 min

4. PCR-Screening — Serogruppen (wenn stx+)

   Wenn stx1 und/oder stx2 nachgewiesen — bereiten Sie 5 PCR-Reaktionen für Serogruppen vor: O157, O111, O26, O103, O145. Gleiches Temperaturprogramm. Positives Ergebnis = Ct < 35.

   ⏱ Zeit: 90 min

5. Screening-Interpretation

   Varianten: (A) stx+ / eae+ / Top5-Serogruppe+ → potenziell positive Probe, Stammisolierung erforderlich. (B) stx+ / eae− oder Serogruppe negativ → STEC vorhanden, aber nicht Top5, berichten. (C) stx− → negative Probe.

6. Stammisolierung (IMS)

   Für Variante (A): Fügen Sie 20 µL immunmagnetische Beads (Anti-O entsprechender Serogruppe) zu 1 mL angereicherter Kultur hinzu. Inkubieren Sie 15–30 min mit Mischen. Trennen Sie auf Magnet. Waschen Sie 3x. Säen Sie auf CT-SMAC (O157) oder chromogenem Agar aus.

   ⏱ Zeit: 2 h

7. Isolat-Bestätigung

   Von CT-SMAC/chromogener Platte wählen Sie typische Kolonien (O157: Sorbitol-, farblos). Bestätigen Sie per PCR — Isolat muss stx1/stx2 + eae + entsprechendes Serogruppengen besitzen. Optional: Latexagglutination (Anti-O157, etc.).

   ⏱ Zeit: 24 h

8. Berichterstattung

   Screening-Ergebnis: "STEC (stx+) nachgewiesen/nicht nachgewiesen in 25 g". Wenn Stamm isoliert: "STEC O157:H7 (stx2+, eae+) isoliert aus 25 g Probe". Positives Ergebnis in Lebensmitteln = RASFF-Benachrichtigung.

   ⏱ Zeit: 10 min

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• STEC — BSL-2-Erreger mit extrem niedriger infektiöser Dosis (10–100 Zellen!), höchste Vorsichtsmaßnahmen verwenden
• Arbeit mit Kulturen ausschließlich in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II
• Getrennte Pre-PCR- und Post-PCR-Zonen — Amplikon-Kontamination verhindern
• Novobiocin — Antibiotikum, Hautkontakt vermeiden
• Gebrauchte Materialien und Kulturen autoklavieren (121°C/30 min) vor Entsorgung
• Bei O157-Verdacht — Benachrichtigung des Referenzlabors erwägen

Häufige Fragen