🦠 STEC (Shigatoxin-bildende Escherichia coli) in Lebensmitteln und Futtermitteln — Anreicherung, Echtzeit-PCR der Gene stx/eae und der Serogruppen, Isolierung

Mikrobiologie ISO/TS 13136

Übersicht

ISO/TS 13136:2012 beschreibt die Identifizierung Shigatoxin-bildender Escherichia coli (STEC) durch den Nachweis der wichtigsten Virulenzgene stx und eae sowie der mit den Serogruppen O157, O111, O26, O103 und O145 verbundenen Gene — der Serogruppen, die für die Mehrzahl der schweren Krankheitsformen einschließlich des hämolytisch-urämischen Syndroms (HUS) verantwortlich sind. Wenn eines oder beide stx-Gene nachgewiesen wurden, wird die Isolierung des Stammes in Angriff genommen; die Isolierung aus Proben, die auf die Gene der Serogruppen positiv sind, lässt sich durch serogruppenspezifische Anreicherungstechniken erleichtern (z. B. immunomagnetische Separation, IMS). Die Referenztechnologie für den Nachweis der Gene ist die Echtzeit-PCR. Die Spezifikation findet Anwendung auf Erzeugnisse, die zum Verzehr durch den Menschen und zur Fütterung der Tiere bestimmt sind, sowie auf Umgebungsproben aus der Herstellung von und dem Verkehr mit Lebensmitteln und aus der Primärproduktion. Die allgemeinen Anforderungen an mikrobiologische Untersuchungen legt ISO 7218 fest.

Die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 (Kriterium 1.29) verlangt für Sprossen den Nichtnachweis von STEC O157, O26, O111, O103, O145 sowie O104:H4 in 25 g und nennt als Referenzverfahren CEN/ISO TS 13136. Das Verfahren umfasst fünf aufeinanderfolgende Stufen: mikrobiologische Anreicherung, Extraktion der Nukleinsäure, Nachweis der Virulenzgene, Nachweis der Gene der Serogruppen und Isolierung aus positiven Proben (Schema in Anhang A; Primer und Sonden in Anhang E; alternativ die klassische PCR mit Detektion im Agarosegel).

Prinzip der Methode

Anreicherung: die Zahl der STEC-Zellen wird erhöht, indem die Einwaage in einem nichtselektiven flüssigen Nährmedium bebrütet wird — in modifizierter Trypton-Soja-Bouillon (TSB mit 1,5 g/l Gallensalzen Nr. 3, mTSB) mit 16 mg/l Novobiocin (mTSB+N) für Matrices mit hoher Begleitmikroflora, in gepuffertem Peptonwasser (BPW) für Proben mit gestressten Zellen (z. B. gefrorene) und geringerer Mikroflora, oder in mTSB mit 12 mg/l Acriflavin (mTSB+A) für Milch und Milcherzeugnisse; Novobiocin und Acriflavin hemmen die grampositiven Bakterien. Die Norm weist darauf hin, dass der Zusatz von Novobiocin umstritten ist — in der üblichen Konzentration von 20 mg/l (ISO 16654) hemmt es das Wachstum von etwa einem Drittel der Nicht-O157-Stämme, daher die verringerten 16 mg/l. Extraktion: die Nukleinsäure wird entsprechend den Anforderungen des angewendeten Detektionssystems extrahiert. Zielgene: die stx-Gene (stx1 und stx2; von den sieben Varianten des stx2 sind stx2a, stx2b und stx2c das Ziel — GenBank X07865, L11078, M59432), das Gen eae, das für Intimin kodiert (ein Protein von 90 kDa, das für den Adhäsionsmechanismus „attaching and effacing" verantwortlich ist, der für STEC typisch ist, die schwere Erkrankungen verursachen) sowie die Gene der Serogruppen: rfbE (O157), wbdI (O111), wzx (O26), ihp1 (O145) und wzx (O103). Nachweis: Echtzeit-PCR nach dem angewendeten System. Isolierung: bei Verdacht auf STEC wird die Isolierung in Angriff genommen — nach dem Nachweis einer der Serogruppen aus dem Anwendungsbereich kann eine spezifische Anreicherung (z. B. IMS) und eine Beimpfung von Trypton-Gallensalz-Glucuronid-Agar (TBX) oder eines spezifischen Selektivnährbodens (Anhang F) durchgeführt werden, um das Isolieren der STEC aus der Begleitflora zu erleichtern.

Anwendungen

• Sprossen (Verordnung 2073/2005, Kriterium 1.29 — STEC O157, O26, O111, O103, O145, O104:H4 in 25 g nicht nachweisbar)
• Milch und Milcherzeugnisse (Anreicherungsvariante mTSB+A mit Acriflavin)
• Gefrorene Erzeugnisse und solche mit geringer Begleitmikroflora (Anreicherung in BPW)
• Umgebungsproben aus der Primärproduktion, aus Herstellungsbetrieben und aus dem Verkehr mit Lebensmitteln
• Amtliche Untersuchungen und Ausbruchsermittlungen — schnelle PCR-Voruntersuchung mit anschließender Isolierung des Stammes

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

ISO/TS 13136:2012 (CEN ISO/TS 13136:2012)

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania mikroorganizmów chorobotwórczych przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) i określania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145 (tłumaczenie robocze)

Title (EN)

Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Wahl der Bouillon und Anreicherung

   Homogenisiere die Einwaage (z. B. 25 g Sprossen) in der auf die Matrix abgestimmten Bouillon: mTSB+N (16 mg/l Novobiocin) bei hoher Mikroflora, BPW bei gestressten Zellen (Tiefkühlware), mTSB+A (12 mg/l Acriflavin) für Milch und Milcherzeugnisse; bebrüte nach der Norm.

2. DNA-Extraktion

   Extrahiere aus der angereicherten Kultur die Nukleinsäure entsprechend den Anforderungen des angewendeten Detektionssystems.

3. Echtzeit-PCR — Virulenzgene

   Weise die stx-Gene (stx1, stx2 — Varianten stx2a/b/c) und eae mit den Primern und Sonden aus Anhang E nach; bewerte das Ergebnis nach dem angewendeten System.

4. Echtzeit-PCR — Gene der Serogruppen

   Weise in den auf stx positiven Proben die Gene rfbE (O157), wbdI (O111), wzx (O26), ihp1 (O145) und wzx (O103) nach.

5. Isolierung

   Wenn stx nachgewiesen wurde: nimm die Isolierung des Stammes in Angriff; führe nach dem Nachweis einer Serogruppe aus dem Anwendungsbereich eine spezifische Anreicherung (z. B. IMS) durch und beimpfe TBX-Agar oder einen spezifischen Selektivnährboden (Anhang F); bestätige die Gene im Isolat.

6. Ergebnis

   Gib den Nachweis/Nichtnachweis von STEC (Gene stx/eae, Serogruppe) in der Einwaage sowie das Ergebnis der Isolierung an; beziehe dich bei Sprossen auf das Kriterium der Verordnung 2073/2005 (in 25 g nicht nachweisbar).

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• STEC (darunter O157) sind Krankheitserreger mit niedriger Infektionsdosis, die HUS verursachen — Arbeit in einem Laboratorium der entsprechenden Sicherheitsstufe, strenge Asepsis, Autoklavieren der Kulturen
• Acriflavin und Novobiocin — den Hautkontakt und das Einatmen der Pulver vermeiden
• Vermeidung der Kontamination mit PCR-Amplikons — Trennung der Prä- und Post-PCR-Zonen, Negativkontrollen

Häufige Fragen