🦠 Staphylococcus aureus in kosmetischen Mitteln — Nachweis nach Anreicherung in einer Bouillon mit Neutralisatoren und Isolierung auf Baird-Parker-Agar

Mikrobiologie PN-EN ISO 22718

Übersicht

Die mikrobiologischen Untersuchungen kosmetischer Mittel werden nach einer mikrobiologischen Risikoanalyse geführt, die von der möglichen Veränderung des Erzeugnisses, von der Pathogenität der Mikroorganismen, vom Ort der Anwendung (Haare, Haut, Augen, Schleimhäute) und von den Anwendern (Erwachsene, Kinder bis 3 Jahre) abhängt. Der Nachweis der Hautpathogene — Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans — ist wesentlich, weil sie Haut- oder Augeninfektionen hervorrufen können. ISO 22718:2015 (zweite Ausgabe, geringfügige Überarbeitung der ISO 22718:2006) gibt allgemeine Leitlinien für den Nachweis und die Identifizierung von S. aureus in kosmetischen Mitteln an; Erzeugnisse mit geringem Risiko (niedrige Wasseraktivität, hydroalkoholische Erzeugnisse, extremer pH-Wert — ISO 29621) bedürfen der Untersuchung möglicherweise nicht. Das Verfahren beruht auf dem Nachweis von S. aureus in einem nichtselektiven flüssigen Nährmedium (Anreicherungsbouillon) und der anschließenden Isolierung auf einem selektiven Agar; für manche Erzeugnisse (z. B. nicht mit Wasser mischbare) kann es ungeeignet sein — dann wird ISO 18415 angewendet —, und alternative Verfahren (z. B. automatische) erfordern den Nachweis der Gleichwertigkeit. S. aureus sind grampositive, in Trauben angeordnete Kokken mit glatten, gewöhnlich gelb pigmentierten Kolonien, katalase- und koagulasepositiv; es ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der auf der Haut gesunder Personen leben kann und in einem kosmetischen Mittel unerwünscht ist. In Polen gilt die Norm als PN-EN ISO 22718:2016-01 und gehört zu den grundlegenden Normen für die Untersuchung der mikrobiologischen Reinheit kosmetischer Mittel (neben PN-EN ISO 21149, 21150, 22717, 18416, 18415).

Prinzip der Methode

Die erste Stufe ist die Anreicherung in einer nichtselektiven Bouillon, um die Zahl der Mikroorganismen zu erhöhen, ohne das Risiko einer Hemmung durch die selektiven Bestandteile; die zweite — die Isolierung auf einem selektiven Nährmedium und die Identifizierungstests. Eine mögliche Hemmung des Wachstums durch die Probe muss neutralisiert und die Wirksamkeit der Neutralisation der antimikrobiellen Eigenschaften des Erzeugnisses überprüft und nachgewiesen werden (Abschnitt 11 der Norm, Neutralisatoren in Anhang B). Die Anreicherungsbouillon Eugon LT 100 enthält neutralisierende Bestandteile — Lecithin und Polysorbat 80 — sowie das dispergierende Octoxinol 9 (Zusammensetzung je 1 l: Caseinhydrolysat 15 g, Sojahydrolysat 5 g, L-Cystin 0,7 g, NaCl 4 g, Natriumsulfit 0,2 g, Glucose 5,5 g, Eilecithin 1 g, Polysorbat 80 5 g, Octoxinol 9 1 g; pH 7,0 ± 0,2; Sterilisation 121 °C 15 min); zulässig sind andere Bouillons (Anhang A), wenn ihre Eignung nachgewiesen wurde. Der selektive Baird-Parker-Agar: Grundnährmedium (Caseinhydrolysat 10 g, Hefeextrakt 1 g, Fleischextrakt 5 g, Natriumpyruvat 10 g, L-Glycin 12 g, Lithiumchlorid 5 g, Agar 12–22 g, Wasser auf 950 ml; pH 7,2 ± 0,2) mit dem Zusatz einer Kaliumtelluritlösung (1 g/100 ml, durch Filtration bei 0,22 µm sterilisiert, bis zu einem Monat bei (3 ± 2) °C aufbewahrt) und einer Eidotteremulsion (etwa 20 %). Für den Eignungstest dienen das Trypton-Salz-Verdünnungsmittel (Trypton 1 g, NaCl 8,5 g/l; pH 7,0 ± 0,2) und der TSA/SCDA-Agar (pH 7,3 ± 0,2); allgemeine Leitlinien — ISO 21148, Teststämme — EN 12353. Wasser: destilliert oder gereinigt nach ISO 21148.

Anwendungen

• Kontrolle der mikrobiologischen Reinheit der Fertigerzeugnisse und der Rohstoffe in der Kosmetikindustrie (Untersuchung vor der Prüfung der Konservierung)
• Kosmetische Mittel für Haut, Haare, Augen und Schleimhäute sowie Erzeugnisse für Kinder bis 3 Jahre — ein Hautpathogen von wesentlicher Bedeutung
• Beurteilung der Hygiene des Herstellungsprozesses (Produktdokumentation des kosmetischen Mittels, GMP)
• Reklamationsuntersuchungen und Chargenfreigaben; Validierung der Neutralisation der Konservierungsmittel

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 22718:2016-01 (ISO 22718:2015)

Titel (PL)

Kosmetyki — Mikrobiologia — Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus

Title (EN)

Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Risikoanalyse und Probe

   Lege anhand der Risikoanalyse (ISO 29621) fest, ob das Erzeugnis der Untersuchung bedarf; entnimm mindestens 1 g oder 1 ml des Erzeugnisses als Probe für die Erstverdünnung.

2. Erstverdünnung und Anreicherung

   Dispergiere die Probe in einem festgelegten Volumen der Anreicherungsbouillon mit Neutralisatoren (Eugon LT 100 oder eine andere mit nachgewiesener Eignung); stelle bei Bedarf Verdünnungen her; bebrüte die Bouillon (Abschn. 9.3 der Norm).

3. Isolierung

   Impfe aus der angereicherten Kultur den Baird-Parker-Agar (oder ein anderes Nährmedium aus Anhang A) und bebrüte ihn; zulässig ist auch die Überimpfung auf ein nichtselektives Nährmedium mit anschließender Identifizierung durch Testsätze.

4. Identifizierung

   Bestätige die Kolonien mit charakteristischem Aussehen auf dem selektiven Nährmedium mit dem Katalase- und dem Koagulase-Test (S. aureus: beide positiv); benutze im Zweifelsfall Identifizierungstestsätze.

5. Eignungstest (Neutralisation)

   Weise parallel nach, dass das Erzeugnis das Wachstum nicht hemmt: Bereite ein Inokulum von S. aureus in der Trypton-Salz-Lösung, gib es zur Probe mit der Bouillon und vergleiche die Wiederfindung mit der Kontrolle auf TSA (Abschn. 11.3); ohne die Bestätigung der Neutralisation ist ein negatives Ergebnis ungültig.

6. Ergebnis und Prüfbericht

   Gib die Anwesenheit oder das Fehlen von S. aureus in der untersuchten Menge des Erzeugnisses, die verwendete Bouillon und das Nährmedium, die Art der Neutralisation sowie das Ergebnis des Eignungstests an (Abschn. 10 und 12).

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• S. aureus ist ein opportunistischer Krankheitserreger (Haut- und Augeninfektionen) — Arbeit unter den Bedingungen eines mikrobiologischen Labors, Dekontamination der Kulturen
• Kaliumtellurit ist giftig — Einwiegen und Ansetzen der Lösung mit Handschuhen, Staubentwicklung vermeiden
• Eidotteremulsion — Sterilität und Hygiene der Zubereitung (Desinfektion der Schalen)

Häufige Fragen