🍎 Fettsäurezusammensetzung von Ölen und Fetten — Methylester (FAME), Gaschromatographie GC-FID

Lebensmittelchemie PN-EN ISO 12966-1

Übersicht

Der Teil 1 der Norm ISO 12966 gibt einen Überblick über die chromatographische Bestimmung der freien und gebundenen Fettsäuren in tierischen und pflanzlichen Ölen und Fetten nach ihrer Überführung in Methylester (FAME). Die quantitative und qualitative Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung mittels Gaschromatographie ist in der Lipidanalytik weit verbreitet — zur Kennzeichnung von Fetten und Ölen sowie fetthaltiger Lebensmittel nach der Extraktion des Fettes aus der Matrix. Die Reihe ISO 12966 (Teile 1–4) hat ISO 5508, ISO 5509 und ISO 15304 ersetzt; sie betrifft rohe, raffinierte, teilweise und vollständig gehärtete Fette sowie Fettsäuren, eignet sich dagegen nicht für Milchfett und Fett von Wiederkäuern, für mit konjugierter Linolsäure (CLA) angereicherte Erzeugnisse und für polymerisierte und oxidierte Fette. Die Herstellung der Ester beschreiben die Teile 2 (chemische Verfahren) und 3 (Trimethylsulfoniumhydroxid, TMSH), und die Bedingungen der Kapillaranalyse der Teil 4.

Die Blockierung der Carboxylgruppen in den Methylestern verhindert die Bildung von Wasserstoffbrücken, was die Siede- und Schmelztemperaturen gegenüber den Säuren senkt und die GC-Analyse ermöglicht. Die Norm stellt die Veresterungsverfahren zusammen: die schnelle Umesterung mit KOH in Methanol (verestert die freien Säuren nicht; auch für Fette mit kurzkettigen Säuren, Gefahr der Seifenbildung), die allgemeine Umesterung/Methylierung mit NaOCH3 (für Laurinöle nicht empfohlen), die Methylierung mit BF3 (eine 14-prozentige methanolische Lösung, gekauft, sehr giftig; für Fischöle), methanolische H2SO4 oder HCl (für Proben mit einem höheren Gehalt an freien Säuren; 3 h in einer verschlossenen Ampulle) sowie TMSH (sehr schnell, C4–C26, Veresterung der freien Säuren zu etwa 80 %, geringe Mengen an trans-Isomeren).

Zur Trennung werden WCOT-Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 0,1–0,53 mm und einer Filmdicke von 0,1–0,3 µm sowie einer Länge von 10–100 m je nach der geforderten Auflösung verwendet; eine Verdopplung der Säulenlänge erhöht die Auflösung nur um den Faktor 1,41. Für komplexe Gemische geometrischer und Stellungsisomere mehrfach ungesättigter Säuren werden 100-m-Säulen mit einer Biscyanopropyl-Phase (SP-2560) oder einer hoch substituierten Cyanopropyl-Phase (CP-Sil 88) empfohlen. Das Trägergas soll beim FID Wasserstoff sein (beim Massendetektor Helium). In der Anleitung der Universität Gdańsk wird die FAME-Analyse von Schweineschmalz auf einer Säule RTX-5 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm mit einem Temperaturprogramm von 120–220 °C geführt.

Prinzip der Methode

Die nach ISO 12966-2 oder ISO 12966-3 hergestellten Methylester (z. B. Umesterung einer Lösung des Fettes in Isooctan mit einer methanolischen KOH-Lösung und anschließender Neutralisation mit Natriumhydrogensulfat), in einem Lösungsmittel gelöst, werden in den Injektor eingespritzt, wo sie verdampfen; die Trennung erfolgt auf einer Kapillarsäule gewählter Polarität und Länge, und die Stoffe verlassen die Säule mit kennzeichnenden Retentionszeiten, die mit den Retentionszeiten eines FAME-Standardgemisches verglichen werden. Nachweis: ein Flammenionisationsdetektor (FID). Die prozentualen Anteile der Fettsäuren werden aus den Peakflächen nach dem Verfahren der internen Normierung berechnet (die Peakfläche als Prozent der Summe) oder genauer mit einem inneren Standard oder mit Korrekturfaktoren des Ansprechverhaltens. Beim Massendetektor sind die Unterschiede in der Fragmentierung der einzelnen FAME zu berücksichtigen.

Anwendungen

• Kennzeichnung und Identifizierung pflanzlicher Öle und tierischer Fette (Fettsäureprofil, gesättigte Säuren, MUFA, PUFA)
• Bestimmung der trans- und der konjugierten Isomere in gehärteten Fetten und in Bratfetten
• Nährwertdeklaration von Lebensmitteln nach der Extraktion des Fettes aus der Matrix
• Nachweis von Verfälschungen von Ölen (z. B. Olivenöl) und Kontrolle der Übereinstimmung mit der Spezifikation
• Berechnung der Iodzahl aus der Fettsäurezusammensetzung (ISO 3961, Anhang B)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 12966-1:2015-01

Titel (PL)

Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce — Chromatografia gazowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych — Część 1: Przewodnik do nowoczesnej chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych

Title (EN)

Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 1: Guidelines on modern gas chromatography of fatty acid methyl esters

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Wahl des Veresterungsverfahrens

   Das Verfahren nach Tabelle 1 der Norm wählen: KOH/Methanol (schnell, ohne Veresterung der freien Säuren), NaOCH3 (nicht für Laurinöle), BF3 (Fischöle), methanolische H2SO4/HCl (hoher Gehalt an freien Säuren, 3 h in einer Ampulle) oder TMSH (sehr schnell, nur Split).

2. Herstellung der FAME (Beispiel UG, KOH)

   In ein Röhrchen mit Teilung 1 ml einer Lösung des Fettes in Isooctan (10 mg/ml) geben, 3 ml Isooctan zugeben und schütteln; 400 µl der methanolischen KOH-Lösung zugeben und etwa 30 s kräftig schütteln — nach dem Trübwerden scheidet sich Glycerin ab und die Mischung wird klar.

   ⏱ Zeit: 30 s

3. Neutralisation

   Etwa 1 g Natriumhydrogensulfat zugeben und schütteln; nachdem das Salz abgesunken ist, die obere Schicht mit den Methylestern mit einer Pipette in ein Vial von 1,5 ml abnehmen.

4. GC-Bedingungen

   Eine dem Zweck entsprechende Säule einbauen (polar 100 m für die Isomere; in den Übungen RTX-5 30 m), Injektor und Detektor einstellen (z. B. 300 °C), das Temperaturprogramm (z. B. 120→220 °C, 3 °C/min) und das Trägergas (Wasserstoff beim FID; an der UG Argon 1,5 ml/min).

5. Analyse des Standards

   1 µl des FAME-Standardgemisches einspritzen und die Retentionszeiten der einzelnen Ester festlegen; bei polaren 100-m-Säulen die Elutionsfolge aus ISO 12966-4 berücksichtigen.

6. Analyse der Probe

   1 µl der FAME-Lösung der Probe unter denselben Bedingungen einspritzen; die Peaks durch Vergleich der Retentionszeiten identifizieren.

7. Berechnungen

   Nach dem Verfahren der internen Normierung den prozentualen Anteil jeder Säure aus den Peakflächen berechnen (Prozent der Summe der Flächen) oder einen inneren Standard / Korrekturfaktoren anwenden; das Ergebnis lässt sich auf mg/g Erzeugnis umrechnen.

8. Prüfbericht

   Das Veresterungsverfahren (den Teil der Norm), die Säule und die chromatographischen Bedingungen, die Art der Berechnung sowie die Fettsäurezusammensetzung angeben.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Bortrifluorid in Methanol ist sehr giftig — nur in verschlossenen Fläschchen und unter dem Abzug arbeiten
• Methanolische Lösungen von KOH und von Säuren sind ätzend, Methanol ist giftig — Schutzbrille, Handschuhe, Abzug
• Wasserstoff als Trägergas — Dichtheitskontrolle der Anlage, Leckdetektor; Isooctan ist leicht entzündlich
• Heißer Injektor und Detektor (300 °C) — während des Betriebs nicht berühren

Häufige Fragen