🦠 Salmonella spp. im Wasser — Nachweis mit Voranreicherung in BPW, selektiver Anreicherung (RVS, MKTTn) und Ausstrich auf XLD

Mikrobiologie PN-EN ISO 19250

Übersicht

ISO 19250:2010 legt ein Verfahren zum Nachweis von Salmonella spp. (präsumtiv oder bestätigt) in Wasserproben fest; für epidemiologische Zwecke oder bei Ausbruchsermittlungen können zusätzliche Nährmedien erforderlich sein. Die Norm weist darauf hin, dass das Verfahren möglicherweise nicht alle Stämme von Salmonella ser. Typhi und ser. Paratyphi wiederfindet. Ein halbquantitatives Vorgehen ist über MPN-Ansätze mit geeigneten Probenvolumina möglich — dann wird das Volumen des gepufferten Peptonwassers angepasst. Der Nachweis erfordert vier aufeinanderfolgende Stufen: die Voranreicherung (sie erlaubt es, geringe Zahlen oder geschädigte Zellen von Salmonella nachzuweisen; manche Stämme benötigen eine längere Bebrütung), die selektive Anreicherung (Salmonella tritt in geringer Zahl in Begleitung weitaus zahlreicherer anderer Enterobacteriaceae auf), den Ausstrich auf feste Nährmedien sowie das Erkennen und die Bestätigung. Für Abwasser liefert eine kürzere Voranreicherung oder der unmittelbare Ausstrich in das selektive Nährmedium bessere Ergebnisse.

Typische Volumina für Trinkwasser sind 1000–5000 ml, die durch Membranfiltration aufkonzentriert werden; für verunreinigte Oberflächenwässer und Abwasser — kleinere. Bei Umgebungstemperatur aufbewahrte Proben werden binnen 12 h nach der Probenahme untersucht; ausnahmsweise sind (5 ± 3) °C bis 24 h zulässig. In Polen gilt sie als PN-EN ISO 19250:2013-07 (polnische Fassung, Veröffentlichungsdatum 20-09-2022). Die inländischen Lieferanten von Nährmedien bieten zu dieser Norm einen vollständigen Satz an: gepuffertes Peptonwasser, RVS-Bouillon, MKTTn-Bouillon, XLD-Agar sowie Seren für die serologischen Bestätigungen (somatische Antigene O und Vi).

Prinzip der Methode

Voranreicherung: Gepuffertes Peptonwasser (BPW) wird bei Umgebungstemperatur mit einem bekannten Volumen der Probe oder ihrer Verdünnungen beimpft und bei (36 ± 2) °C über (18 ± 2) h bebrütet — Volumina unter 10 ml werden zu 50 ml BPW gegeben; Volumina über 10 ml werden durch ein steriles Membranfilter mit einer Porenweite von 0,45 µm filtriert, das in 50 ml BPW eingetaucht wird (für trübe Wässer wird ein Filterhilfsmittel verwendet, typischerweise 15 ml auf der Unterlage und 15 ml mit der Probe vermischt; Endvolumen des BPW 100 ml); die Kultur kann auch in eine MPN-Reihe aufgeteilt werden. Selektive Anreicherung: 0,1 ml der Kultur werden in 10 ml Rappaport-Vassiliadis-Soja-Bouillon (RVS) überführt, die bei (41,5 ± 1,0) °C über (24 ± 3) h bebrütet wird (42,5 °C nicht überschreiten), und erforderlichenfalls — zum Nachweis langsam wachsender Stämme — weitere (24 ± 3) h bis zu insgesamt (48 ± 4) h; parallel werden 1 ml in 10 ml Muller-Kauffmann-Tetrathionat-Novobiocin-Bouillon (MKTTn) überführt, die bei (36 ± 2) °C über (24 ± 3) h bebrütet wird (MKTTn findet die meisten Stämme wieder, darunter einen Teil von S. Paratyphi, nicht aber S. Paratyphi C; sie wird nicht verwendet, wenn nach Selenit-Cystin-Bouillon S. Typhi vermutet wird). Ausstrich: Aus jeder selektiven Kultur wird auf Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar (XLD) ausgestrichen, der mit dem Boden nach oben bei (36 ± 2) °C bebrütet und nach (24 ± 3) h auf präsumtive Salmonella-Kolonien durchgesehen wird, sowie auf ein zweites festes selektives Nährmedium, das zum XLD komplementär und nach Bedarf für lactosepositive Stämme, S. Typhi und S. Paratyphi geeignet ist (z. B. Brillantgrün-Agar, Bismutsulfit-Agar), bebrütet nach den Empfehlungen des Herstellers. Bestätigung: Die präsumtiven Kolonien werden subkultiviert und mit geeigneten biochemischen und serologischen Prüfungen bestätigt.

Anwendungen

• Trinkwasser und Grundwässer — große Volumina von 1000–5000 ml, aufkonzentriert durch Membranfiltration
• Verunreinigte Oberflächenwässer und Abwasser (kleinere Volumina; für Abwasser kürzere Voranreicherung oder unmittelbarer Ausstrich)
• Epidemiologische Ermittlungen und Ausbruchsermittlungen (mit zusätzlichen Nährmedien; Vorsicht bei S. Typhi und S. Paratyphi)
• Halbquantitative MPN-Bestimmung von Salmonella mit einer Reihe von Probenvolumina
• Kontrolle der Wirksamkeit der Aufbereitung und der Reinigung in Wasserwerks- und Sanitärlaboratorien

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 19250:2013-07 (ISO 19250:2010)

Titel (PL)

Jakość wody — Wykrywanie Salmonella spp.

Title (EN)

Water quality — Detection of Salmonella spp.

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme und Lagerung

   Nimm die Probe und beginne die Untersuchung binnen 12 h (Umgebungstemperatur); bewahre sie ausnahmsweise bei (5 ± 3) °C bis 24 h auf. Wähle das Volumen: Trinkwasser 1000–5000 ml, verunreinigte Wässer und Abwasser — weniger.

2. Voranreicherung — Volumina < 10 ml

   Beimpfe 50 ml BPW bei Umgebungstemperatur mit der Probe oder ihrer Verdünnung und bebrüte bei (36 ± 2) °C über (18 ± 2) h.

3. Voranreicherung — Volumina > 10 ml

   Filtriere die Probe durch ein steriles Membranfilter von 0,45 µm (für trübe Wässer: etwa 15 ml Filterhilfsmittel auf der Unterlage und 15 ml mit der Probe vermischt), tauche das Filter in 50 ml BPW (endgültig 100 ml BPW) und bebrüte bei (36 ± 2) °C über (18 ± 2) h; für die MPN teile auf eine Reihe von Röhrchen auf.

4. Selektive Anreicherung

   Überführe 0,1 ml der Kultur in 10 ml RVS-Bouillon und bebrüte bei (41,5 ± 1,0) °C über (24 ± 3) h (überschreite 42,5 °C nicht; verlängere erforderlichenfalls auf insgesamt (48 ± 4) h). Parallel 1 ml in 10 ml MKTTn, (36 ± 2) °C, (24 ± 3) h.

5. Ausstrich auf feste Nährmedien

   Streiche aus jeder selektiven Kultur auf XLD-Agar und auf das zweite selektive Nährmedium aus; bebrüte das XLD mit dem Boden nach oben bei (36 ± 2) °C und sieh es nach (24 ± 3) h durch, das zweite Nährmedium — nach den Empfehlungen des Herstellers. Markiere die präsumtiven Salmonella-Kolonien.

6. Bestätigung

   Subkultiviere die präsumtiven Kolonien (wiederhole den Ausstrich wie in Schritt 5; nach (24 ± 3) h bei (36 ± 2) °C) und bestätige sie mit biochemischen und serologischen Prüfungen (Antigene O, Vi).

7. Ergebnis

   Gib den Nachweis von Salmonella spp. (präsumtiv oder bestätigt) oder deren Nichtnachweis im untersuchten Wasservolumen an; bei einer MPN-Reihe — die MPN.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Salmonella spp. sind Darmpathogene (darunter S. Typhi) — Arbeit unter den Bedingungen eines mikrobiologischen Labors, Desinfektion und Autoklavieren aller Kulturen
• RVS-Bouillon bei 41,5 °C und Nährmedien nach dem Autoklavieren — Verbrennungsgefahr
• Filtration großer Volumina unter Vakuum — einwandfreie Glasgeräte, Aseptik beim Überführen des Filters

Häufige Fragen