🦠 Präsumtive Pseudomonas spp. in Fleisch und Fleischerzeugnissen — Oberflächenverfahren auf CFC-Agar (25 °C, 44 h)

Mikrobiologie PN-EN ISO 13720

Übersicht

ISO 13720:2010 legt ein Verfahren zur Zählung der präsumtiven Pseudomonas spp. fest, die in Fleisch und Fleischerzeugnissen, einschließlich Geflügelerzeugnissen, vorkommen. Präsumtive Pseudomonas spp. sind nach der Norm Bakterien, die bei 25 °C auf einem Agar mit Cefalotin, Natriumfusidat und Cetrimid (CFC) Kolonien bilden und einen positiven Oxidase-Test ergeben. In Polen gilt sie als PN-EN ISO 13720:2010 (sie ersetzte PN-ISO 13720:1999).

Das CFC-Nährmedium ist als Basis (Pseudomonas Agar Base) mit CFC-Supplement im Handel erhältlich; der Hersteller des Nährmediums beschreibt es als selektives Nährmedium zum Nachweis und zur Zählung von Pseudomonas spp. nach ISO 13720 (Fleisch und Fleischerzeugnisse), mit abweichenden Supplementen für Milch (ISO/TS 11059, Supplement PP) und für Wasser (ISO 16266, Supplement CN). Typische Zusammensetzung der Basis: Gelatinepepton 16,0 g/l, Caseinhydrolysat 10,0 g/l, Kaliumsulfat wasserfrei 10,0 g/l, Magnesiumchlorid wasserfrei 1,4 g/l, Agar 15,0 g/l, pH 7,1 ± 0,2; Kaliumsulfat und Magnesiumchlorid begünstigen die Bildung von Pyocyanin, und Glycerin ist die Kohlenstoff- und Energiequelle. Das CFC-Supplement enthält Cetrimid, Fusidinsäure und Cephaloridin; alle auf CFC gewachsenen Kolonien gelten als verdächtige Pseudomonas spp., und bestätigt werden die oxidasepositiven und Glucose nicht vergärenden Kolonien.

Prinzip der Methode

Aus der Probe werden eine Erstverdünnung und Zehnerverdünnungen hergestellt. Der feste Selektivnährboden — CFC-Agar — wird mit einer festgelegten Menge der Erstverdünnung beimpft, und weitere Platten werden aus den Zehnerverdünnungen angelegt; nach ISO 7218 wird eine Platte je Verdünnung mit mindestens zwei aufeinanderfolgenden Verdünnungen verwendet. Mit der Pipette werden 0,1 ml der Erstverdünnung auf eine CFC-Platte und 0,1 ml der ersten Zehnerverdünnung auf die nächste (mit einer neuen sterilen Pipette) übertragen, worauf die Flüssigkeit mit einem sterilen Spatel über die gesamte Agaroberfläche verteilt wird. Die Platten werden 44 h ± 4 h bei 25 °C ± 1 °C bebrütet. Die Kolonien der präsumtiven Pseudomonas spp. werden mit dem Oxidase-Test bestätigt (positiv), und die Zahl je Milliliter oder Gramm wird aus der Zahl der bestätigten Kolonien je Platte berechnet. Das vollständige Nährmedium wird aus dem Basisnährmedium hergestellt (pH nach der Sterilisation 7,2 ± 0,2 bei 25 °C; Sterilisation 15 min bei 121 °C), dem nach dem Abkühlen im Wasserbad auf 47 °C ± 2 °C die Inhibitorlösungen zugesetzt werden: auf 100 ml Nährmedium 5 ml Cefalotinlösung (Endgehalt 50 µg/ml), 1 ml Natriumfusidatlösung (10 µg/ml) und 1 ml Cetrimidlösung (10 µg/ml); die Inhibitorlösungen werden nicht länger als 7 Tage bei 5 °C ± 3 °C aufbewahrt. In sterile Platten werden etwa 15 ml des vollständigen Nährmediums gegossen; ungetrocknete Platten können bis zu 4 Wochen bei 5 °C ± 3 °C aufbewahrt werden.

Anwendungen

• Fleisch und Fleischerzeugnisse, einschließlich Geflügelerzeugnisse — Zählung der präsumtiven Pseudomonas spp. (Anwendungsbereich der Norm)
• CFC-Nährmedium nach Angaben des Herstellers: Isolierung von Pseudomonas spp. aus Fleisch und Fleischerzeugnissen, Milchprodukten, Wasser und Umgebungsproben
• Betriebs- und amtliche Laboratorien für die Untersuchung von Fleischrohware — handelsübliches Nährmedium (Basis + CFC-Supplement)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 13720:2010 (ISO 13720:2010)

Titel (PL)

Mięso i przetwory mięsne — Oznaczanie liczby przypuszczalnych Pseudomonas sp.

Title (EN)

Meat and meat products — Enumeration of presumptive Pseudomonas spp.

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Herstellung des CFC-Agars

   Stelle den Basisnährboden her (pH 7,2 ± 0,2 nach der Sterilisation), sterilisiere ihn 15 min bei 121 °C, kühle ihn im Wasserbad auf 47 °C ± 2 °C ab und gib auf je 100 ml 5 ml Cefalotinlösung, 1 ml Natriumfusidatlösung und 1 ml Cetrimidlösung zu (die Lösungen ≤ 7 Tage bei 5 °C ± 3 °C); mische vorsichtig und gieße etwa 15 ml in sterile Platten (ungetrocknete Platten ≤ 4 Wochen bei 5 °C ± 3 °C).

2. Erstverdünnung und Verdünnungen

   Stelle aus der Fleischprobe eine Erstverdünnung und Zehnerverdünnungen her.

3. Beimpfung nach dem Oberflächenverfahren

   Übertrage mit der Pipette 0,1 ml der Erstverdünnung auf eine CFC-Platte; mit einer neuen sterilen Pipette 0,1 ml der ersten Zehnerverdünnung auf die nächste Platte (eine Platte je Verdünnung, mindestens zwei aufeinanderfolgende Verdünnungen). Verteile die Flüssigkeit mit einem sterilen Spatel über die gesamte Agaroberfläche.

4. Bebrütung

   Bebrüte die Platten 44 h ± 4 h bei 25 °C ± 1 °C.

5. Bestätigung

   Bestätige die Kolonien der präsumtiven Pseudomonas spp. mit dem Oxidase-Test (positiv).

6. Berechnung und Ergebnis

   Berechne aus der Zahl der bestätigten Kolonien je Platte die Zahl der präsumtiven Pseudomonas spp. je Gramm oder Milliliter der Probe.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Rohes Fleisch kann Krankheitserreger enthalten (Salmonella, Campylobacter) — aseptisches Arbeiten, Desinfektion, Autoklavieren der Kulturen
• Antibiotika (Cefalotin, Fusidinsäure) und Cetrimid — das Einatmen der Pulver und den Hautkontakt vermeiden, Handschuhe
• Nährmedium bei 47 °C und nach dem Autoklavieren — Verbrennungsgefahr

Häufige Fragen