🧫 Pseudomonas aeruginosa im Wasser
Nachweis und quantitative Bestimmung von Pseudomonas aeruginosa im Wasser mittels Membranfiltration auf CN-Medium (Cetrimid-Nalidixinsäure). Wichtiger Krankheitserreger in Flaschen- und Schwimmbadwasser.
Übersicht
Pseudomonas aeruginosa ist ein gramnegatives, aerobes Stäbchenbakterium, einer der wichtigsten opportunistischen Krankheitserreger in der aquatischen Umgebung. Dieses Bakterium kann sich in Wasser mit sehr geringem Nährstoffgehalt vermehren, bildet Biofilme auf Oberflächen von Wasserinstallationen, ist resistent gegenüber vielen Desinfektionsmitteln und Antibiotika. Es kann Wundinfektionen, Außenohrentzündungen (Schwimmer-Otitis), Harnwegsinfektionen und schwere Krankenhausinfektionen bei immunsupprimierten Patienten verursachen.
P. aeruginosa ist kein typischer Indikator für fäkale Kontamination — das Bakterium stammt hauptsächlich aus der Umwelt (Boden, Vegetation, Biofilme in Installationen). Seine Anwesenheit in Flaschen- oder Schwimmbadwasser deutet auf Hygieneprobleme im Produktions-, Lager- oder Verteilungsprozess hin. Es ist ein Pflichtparameter für Flaschenwasser, Schwimmbadwasser und Wasser in Gesundheitseinrichtungen.
Die Methode nach PN-EN ISO 16266 verwendet Membranfiltration und Kultur auf Selektivmedium mit Cetrimid (Cetyltrimethylammoniumbromid — kationisches Detergens, das das Wachstum der meisten Bakterien außer Pseudomonas hemmt) und Nalidixinsäure (Hemmer chinolon-empfindlicher gramnegativer Bakterien). P.-aeruginosa-Kolonien produzieren charakteristische Pigmente: Pyocyanin (blaugrün) oder Fluorescein (gelbgrün fluoreszierend).
Die Bestätigung umfasst den Ammoniakproduktionstest aus Acetamid (Nessler-Reagenz) — positiv für P. aeruginosa — und optional das Wachstum bei 42°C und den Oxidase-Test.
Prinzip der Methode
Die Wasserprobe wird durch eine 0,45-µm-Membran filtriert und auf CN-Medium (Pseudomonas-CN-Agar) aufgelegt, das Cetrimid (0,2 g/L) und Nalidixinsäure (15 mg/L) enthält. Inkubation bei 36±2°C für 40–48 h. Cetrimid hemmt die meisten Bakterien außer Pseudomonas spp. — es wirkt als kationisches Detergens, das Zellmembranen schädigt. P. aeruginosa produziert lösliche Pigmente: Pyocyanin (blaugrün, bei Tageslicht sichtbar) und/oder Fluorescein (gelbgrün, fluoreszierend unter UV 365 nm). Kolonien, die Pyocyanin produzieren, erfordern keine Bestätigung. Fluoreszierende oder braunrote Kolonien erfordern den Acetamid-Test.
Anwendungen
- Untersuchung von Flaschen- und Quellwasser (Pflichtparameter)
- Überwachung von Wasser in Schwimmbädern und Wasserparks
- Kontrolle von Wasser in Krankenhäusern und Gesundheitseinrichtungen
- Untersuchung von Trinkwasser in öffentlichen Gebäuden
- Bewertung der Wasserqualität in Kühlinstallationen (Kühltürme)
- Kontrolle von Biofilmen in Wasserverteilungssystemen
- Untersuchung von Wasser für Dialyse- und Pharmazwecke
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Ergebnis | KBE/250 mL (Flaschenwasser) oder KBE/100 mL |
| Zulässiger Wert | 0 KBE/250 mL (Flaschenwasser) |
| Inkubationstemperatur | 36 ± 2°C |
| Inkubationszeit | 40–48 Stunden |
| UV-Lampe | 365 nm zur Fluoreszenzbeobachtung |
| Probenvolumen | 250 mL (Flaschenwasser), 100 mL (andere) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 16266:2009
- Titel (PL)
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Metoda filtracji membranowej
- Title (EN)
- Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Arbeitsplatzvorbereitung
Filtrationsset sterilisieren. Pseudomonas-CN-Agar-Platten vorbereiten (30 min vor Gebrauch aus dem Kühlschrank nehmen).
2. Membranfiltration
250 mL Probe (Flaschenwasser) oder 100 mL (andere Wässer) durch 0,45-µm-Filter filtrieren. Trichter mit sterilem Peptonwasser nachspülen.
3. Übertragung auf Medium
Mit steriler Pinzette den Filter auf die Pseudomonas-CN-Agar-Oberfläche übertragen. Luftblasen vermeiden.
4. Inkubation
Umgedrehte Platten bei 36±2°C für 40–48 Stunden inkubieren. Vorläufige Bewertung nach 24 h möglich.
5. Ablesung — Pyocyanin-Produktion
Kolonien bei Tageslicht prüfen. Blaugrüne Kolonien (Pyocyanin) = bestätigtes P. aeruginosa ohne weitere Tests.
6. Ablesung — UV-Fluoreszenz
Platten unter UV-Lampe 365 nm untersuchen. Gelbgrün fluoreszierende Kolonien ohne Pyocyanin → erfordern Bestätigung.
7. Bestätigungstest — Acetamid
Bestätigungsbedürftige Kolonien in Röhrchen mit Acetamid-Medium überführen. Bei 36°C/24 h inkubieren. Nessler-Reagenz hinzufügen — gelbe Verfärbung = NH₃ = P. aeruginosa (+).
8. Wachstumstest bei 42°C (optional)
Kolonien auf Nähragar überführen und bei 42°C/24 h inkubieren. Wachstum bestätigt P. aeruginosa (andere Pseudomonas wachsen nicht bei 42°C).
9. Ergebnisberechnung
Ergebnis = Anzahl bestätigter Kolonien / Probenvolumen. Angabe in KBE/250 mL (Flaschenwasser) oder KBE/100 mL.
10. Qualitätskontrolle
Positivkontrolle: P. aeruginosa ATCC 27853. Negativkontrolle: steriles Wasser. Selektivitätskontrolle: E. coli ATCC 25922 (kein Wachstum).
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Membranfiltrationsanlage | Sartorius Combisart, Merck EZ-Fit | 3 000–12 000 PLN |
| Vakuumpumpe | KNF Laboport N 810 | 3 000–8 000 PLN |
| Brutschrank 36°C | Binder BD 56, Memmert IN30 | 5 000–15 000 PLN |
| UV-Lampe 365 nm (Wood) | Vilber Lourmat VL-6.L, Analytik Jena UVhand | 500–3 000 PLN |
| Autoklav | Tuttnauer ELV 2540 | 20 000–45 000 PLN |
| Brutschrank 42°C (Bestätigung) | Binder BD 23 | 5 000–15 000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank | Esco Airstream | 15 000–40 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Pseudomonas-CN-Agar | — | Selektivmedium mit Cetrimid und Nalidixinsäure + Glycerin. Hersteller: Oxoid, Merck, Biokar |
| Cetrimid (Cetyltrimethylammoniumbromid) | 57-09-0 | Kationisches Detergens, selektiver Hemmstoff, Konzentration 0,2 g/L im Medium |
| Nalidixinsäure | 389-08-2 | Hemmer empfindlicher gramnegativer Bakterien, Konzentration 15 mg/L im Medium |
| Nessler-Reagenz (K₂HgI₄) | 7783-33-7 | Zum Nachweis von Ammoniak aus Acetamid — gelbe/braune Verfärbung = positives Ergebnis. WARNUNG: enthält Quecksilber! |
| Acetamid (CH₃CONH₂) | 60-35-5 | Medium für den Bestätigungstest — P. aeruginosa desaminiert Acetamid zu Ammoniak |
| Membranfilter 0,45 µm | — | MCE, 47 mm, steril. Merck Millipore, Sartorius |
| Natriumthiosulfat (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Neutralisierung von Chlor in Proben |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- P. aeruginosa — opportunistischer Krankheitserreger, BSL-2. Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille. In Laminar-Flow-Werkbank arbeiten
- Nessler-Reagenz — enthält Quecksilber (Hg), hochgiftig! Nur im Abzug verwenden, Nitrilhandschuhe, Entsorgung als Sonderabfall
- Cetrimid — reizend für Haut und Augen. Schutzhandschuhe verwenden
- Nalidixinsäure — Hautkontakt vermeiden, mögliche allergische Reaktionen
- Infektiöses Material — vor Entsorgung autoklavieren 121°C/30 min