🦠 Pseudomonas aeruginosa im Wasser — MPN-Verfahren mit enzymatischem Nährmedium (Pseudalert / Quanti-Tray)

Mikrobiologie PN-EN ISO 16266-2

Übersicht

ISO 16266-2:2018 legt ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Pseudomonas aeruginosa im Wasser fest, das auf dem Wachstum in einem flüssigen Nährmedium und der Berechnung der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN) aus Tabellen beruht. Es wird für viele Wasserarten angewendet: Krankenhauswässer, Trinkwasser, stille abgefüllte Wässer, Grundwässer, Schwimmbad- und Whirlpoolwässer, auch solche mit hohem Hintergrund an heterotrophen Bakterien. Es gilt nicht für abgefüllte kohlensäurehaltige und aromatisierte Wässer, für Wässer aus Kühltürmen und für Meerwässer, für die das Verfahren nicht validiert wurde — das Laboratorium darf es dort nach eigener Validierung anwenden. Abgefüllte Wässer werden gewöhnlich in einem Volumen von 250 ml untersucht, die übrigen in 100 ml. Die Forderung der Abwesenheit von P. aeruginosa in 250 ml stammte aus der Richtlinie 98/83/EG, die durch die Richtlinie (EU) 2020/2184 AUFGEHOBEN wurde; in der polnischen Verordnung vom 22. Mai 2026 (Dz.U. 2026 Pos. 748 — poln. Gesetzblatt) ist P. aeruginosa in Anlage Nr. 1 Teil A Tabelle 2 und 3 aufgeführt — für Wasser in Tankwagen und Behältern von Transportmitteln, in einem Volumen von 100 ml, und nicht für in Flaschen abgefülltes Wasser.

Der Test beruht auf der Technologie des Nachweises eines bakteriellen Enzyms: aktiv wachsende Stämme von P. aeruginosa besitzen ein Enzym, das das im Nährmedium enthaltene Aminopeptidase-Substrat des 7-Amido-4-methylcumarins spaltet und dabei ein im UV fluoreszierendes Produkt freisetzt; die Bakterien wachsen dank eines reichen Satzes von Aminosäuren, Vitaminen und Nährstoffen rasch. Das Ergebnis ist innerhalb von 24 h bestätigt, ohne dass die positiven Vertiefungen weiter bestätigt werden müssten. Die meisten Stämme von P. aeruginosa wachsen bei 42 °C, nicht aber bei 4 °C, was sie von P. fluorescens unterscheidet. Die Norm verweist auf die Handelsprodukte Pseudalert und Quanti-Tray. In Polen gilt sie als PN-EN ISO 16266-2:2022-04 (polnische und englische Fassung). Der Hersteller gibt für Pseudalert dieselben Bedingungen an: Bebrütung bei (38 ± 0,5) °C über 24–28 h, Ablesen der Fluoreszenz im UV, Nachweisgrenze 1 KBE/100 ml.

Prinzip der Methode

Eine Packung (Snap Pack) des dehydratisierten Nährmediums — 2,45 g je 100 ml — wird zu einer Wasserprobe von 100 ml oder 250 ml oder zu einer auf 100 ml aufgefüllten Verdünnung gegeben und bis zum Lösen sanft geschüttelt. Für die quantitative Bestimmung werden 100 ml der Probe mit dem Nährmedium aseptisch in ein Quanti-Tray (bis 201 Organismen/100 ml; erwartete Zahlen < 200 MPN/100 ml) oder ein Quanti-Tray/2000 (bis 2419 Organismen/100 ml) gefüllt, im Quanti-Tray-Siegelgerät versiegelt und bei (38 ± 0,5) °C über 24–28 h bebrütet; das Ergebnis ist nach 24 h bestätigt, kann aber bis 28 h abgelesen werden. Bei 250 ml wird die Probe auf drei sterile durchsichtige Gefäße aufgeteilt: zwei Portionen zu je 100 ml und eine zu 50 ml, die mit 50 ml sterilem, nicht hemmendem und oxidationsmittelfreiem Wasser aufgefüllt wird; zu jeder wird eine Packung des Nährmediums gegeben, und es wird in drei Trays gefüllt, die eindeutig zu kennzeichnen sind (das Tray mit der 50-ml-Portion wird anders gezählt). Nach der Bebrütung gelten Gefäße oder Vertiefungen als positiv, die im langwelligen UV (365 nm) im Vergleich zur Negativkontrolle einen beliebigen Grad blauer Fluoreszenz zeigen; bei Zweifeln nach 24 h wird die Bebrütung auf 28 h verlängert. Die MPN je 100 ml oder 250 ml wird aus den statistischen Tabellen (B.1, B.2) oder einem Programm abgelesen; für 250 ml wird die Formel B.2 für drei Trays verwendet. Die Vertiefungen des Quanti-Tray fassen etwa 1,96 ml, die Überlaufvertiefung etwa 8,5 ml; im Quanti-Tray/2000 die kleinen etwa 0,16 ml, die großen etwa 1,9 ml, die Überlaufvertiefung etwa 11 ml (sie wird zu den großen gezählt). Das Nährmedium kann auch in sterile Röhrchen in der klassischen MPN-Anordnung gefüllt werden (z. B. 1 × 50 ml und 5 × 10 ml) oder die gesamte Probe kann als Anwesenheits-/Abwesenheitstest bebrütet werden. Qualitätskontrolle: Leistungsfähigkeit — P. aeruginosa WDCM 00024 (blaue Fluoreszenz, PR ≥ 0,5 bezogen auf TSA), Selektivität — P. fluorescens WDCM 00115 (vollständige Hemmung, keine Fluoreszenz).

Anwendungen

• Wasser in Krankenhäusern und Einrichtungen der Gesundheitsversorgung (P. aeruginosa als opportunistischer Erreger in den Installationen)
• Trinkwasser und stille abgefüllte Wässer — Forderung der Abwesenheit von P. aeruginosa in 250 ml
• Schwimmbad- und Whirlpoolwässer, Grundwässer — auch mit hohem Hintergrund an heterotrophen Bakterien
• Anwesenheits-/Abwesenheitstest und klassische MPN-Röhrchenanordnung mit demselben Nährmedium
• Laboratorien der Wasserwerke und der Sanitär- und Epidemiologiestationen — nach 24 h bestätigtes Ergebnis ohne Bestätigungsausstriche

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 16266-2:2022-04 (ISO 16266-2:2018)

Titel (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Część 2: Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Part 2: Most probable number method

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme und Transport

   Nimm die Probe nach den Grundsätzen der ISO 19458; beginne die Untersuchung am Tag der Probenahme oder binnen 12 h; bewahre sie ausnahmsweise bei (5 ± 3) °C bis 24 h auf und vermerke die Lagerungszeit im Prüfbericht.

2. Zugabe des Nährmediums — 100 ml

   Gib zu 100 ml der Probe (oder einer auf 100 ml aufgefüllten Verdünnung) in einem sterilen, durchsichtigen Gefäß aseptisch eine Packung des Nährmediums Pseudalert und mische bis zum vollständigen Lösen.

3. Zugabe des Nährmediums — 250 ml

   Teile die Probe auf drei Gefäße auf: 100 ml, 100 ml und 50 ml; fülle die Portion von 50 ml mit 50 ml sterilem, nicht hemmendem und oxidationsmittelfreiem Wasser auf. Gib zu jeder Portion eine Packung des Nährmediums und mische; kennzeichne die Trays (welches die 50-ml-Portion enthält).

4. Füllen und Versiegeln

   Gieße jede Portion mit Nährmedium in ein Quanti-Tray (erwartet < 200 MPN/100 ml) oder ein Quanti-Tray/2000 und versiegle es. Alternativ fülle in sterile Röhrchen in MPN-Anordnung (z. B. 1 × 50 ml und 5 × 10 ml) oder bebrüte das Ganze als Anwesenheits-/Abwesenheitstest.

5. Bebrütung

   Bebrüte die Trays oder Gefäße 24–28 h bei (38 ± 0,5) °C.

6. Auswertung

   Betrachte sie im UV bei 365 nm im Vergleich zur Negativkontrolle: jede Vertiefung mit einem beliebigen Grad blauer Fluoreszenz ist positiv für P. aeruginosa. Verlängere bei zweifelhafter Fluoreszenz nach 24 h die Bebrütung auf 28 h; die Gummieinlage erleichtert das Ablesen.

7. Berechnung und Prüfbericht

   Lies aus der Zahl der positiven Vertiefungen die MPN/100 ml aus den Tabellen B.1/B.2 oder mit einem Programm ab; berechne für 250 ml die MPN aus drei Trays nach der Formel B.2. Gib im Prüfbericht das Verfahren, die Kennzeichnung der Probe, das Ergebnis und eine etwaige Lagerung bei (5 ± 3) °C bis 24 h an.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• P. aeruginosa ist ein opportunistischer Erreger — Arbeit unter den Bedingungen eines mikrobiologischen Labors, Autoklavieren der gebrauchten Trays
• UV-Lampe 365 nm — Augen- und Hautschutz beim Ablesen
• Das Siegelgerät wird heiß — die Heizelemente nicht berühren

Häufige Fragen