🦠 Präsumtive Escherichia coli in Lebensmitteln — MPN (Laurylsulfat-Bouillon 37 °C → EC-Bouillon 44 °C → Indol)

Mikrobiologie PN-ISO 7251

Übersicht

ISO 7251:2005 gibt allgemeine Leitlinien für den Nachweis und die Zahlbestimmung präsumtiver Escherichia coli nach der Technik der Bebrütung in einem flüssigen Nährmedium und der Berechnung der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN) nach der Bebrütung bei 37 °C und anschließend bei 44 °C an; sie wird auf Erzeugnisse für Menschen und Tiere sowie auf Umgebungsproben aus der Herstellung von und dem Verkehr mit Lebensmitteln angewendet. Achtung: Manche krankheitserregenden Stämme von E. coli wachsen bei 44 °C nicht. Eine Einschränkung ist die große Streuung des Verfahrens (Abschnitt 10). Die dritte Ausgabe ersetzte ISO 7251:1993 sowie ISO 11866-1:1997 und IDF 170-1:1999; die wichtigsten Änderungen: die Temperatur der zweiten Bebrütung 44 °C ± 1 °C, die Einbeziehung von Nachweis und Zahlbestimmung, die Zulassung von fünf Röhrchen je Verdünnung für manche Erzeugnisse, der Hinweis auf Milcherzeugnisse, die das Auffangen des Gases erschweren, sowie die Berechnung der MPN nach ISO 7218. Präsumtive E. coli werden als Bakterien definiert, die bei 44 °C Lactose unter Gasbildung vergären und bei 44 °C aus Tryptophan Indol bilden. In den polnischen Lebensmittellaboratorien wird dieses Verfahren (PN-ISO 7251:2006) neben den Plattenverfahren der ISO 16649 zur Bestimmung von E. coli in Erzeugnissen angewendet, in denen geringe Zahlen zu erwarten sind; die Skripte der UWM beschreiben die entsprechende MPN-Bestimmung von Enterobacteriaceae und coliformen Keimen in der Drei-Röhrchen-Anordnung.

Prinzip der Methode

Nachweis: Die flüssige selektive Anreicherungsbouillon wird mit einer festgelegten Menge der Erstverdünnung beimpft und bei 37 °C bis zu 48 h bebrütet, wobei das Gas nach 24 h und 48 h geprüft wird; bei Trübung oder Gas wird in die EC-Bouillon überimpft und bei 44 °C bis zu 48 h bebrütet; die Röhrchen mit Gas werden in Peptonwasser ohne Indol überimpft und 48 h bei 44 °C bebrütet, anschließend wird die Bildung von Indol aus Tryptophan geprüft; Röhrchen mit Gas in der EC-Bouillon und mit Indol gelten als präsumtive E. coli enthaltend (Ergebnis „nachgewiesen/nicht nachgewiesen in x g oder x ml"). Zahlbestimmung: Drei Röhrchen mit doppelt und drei mit einfach konzentrierter Bouillon werden mit einer festgelegten Menge der Erstverdünnung beimpft, die weiteren Dreiergruppen — mit den Zehnerverdünnungen; das Vorgehen ist wie oben, und die MPN wird aus einer Tabelle (Anhang A) nach der Zahl der Röhrchen abgelesen, deren Überimpfungen bei 44 °C Gas in der EC-Bouillon und Indol ergaben. Laurylsulfat-Bouillon: Hydrolysat pflanzlicher und tierischer Gewebe 20 g (40 g doppelt konzentriert), Lactose 5 g (10 g), K₂HPO₄ 2,75 g (5,5 g), KH₂PO₄ 2,75 g (5,5 g), NaCl 5 g (10 g), Natriumlaurylsulfat 0,1 g (0,2 g)/l; pH 6,8 ± 0,2; 9 ml in Röhrchen 16 × 160 mm mit Durham-Röhrchen (einfach konzentriert) und 10 ml in 18 × 180 oder 20 × 200 mm mit Durham-Röhrchen (doppelt konzentriert); 121 °C 15 min. EC-Bouillon: Caseinhydrolysat 20 g, Lactose 5 g, Gallensalze Nr. 3 1,5 g, K₂HPO₄ 4 g, KH₂PO₄ 1,5 g, NaCl 5 g/l; pH 6,8 ± 0,2; 10 ml mit Durham-Röhrchen. Peptonwasser ohne Indol: Caseinhydrolysat 10 g, NaCl 5 g/l; pH 7,3 ± 0,2; 5–10 ml. Kovacs-Reagenz: 4-Dimethylaminobenzaldehyd 5 g, 2-Methylbutan-1-ol oder Pentan-1-ol 75 ml, HCl (ρ 1,18–1,19) 25 ml; Lösen im Bad bei 50–55 °C, Aufbewahrung bei etwa 4 °C ohne Licht; Farbe hellgelb bis hellbraun.

Anwendungen

• Nachweis und Bestimmung geringer Zahlen von E. coli in Lebensmitteln (Fleisch, Milcherzeugnisse, Feinkosterzeugnisse, verzehrfertige Lebensmittel)
• Umgebungsproben aus den Bereichen der Herstellung von und des Verkehrs mit Lebensmitteln
• Futtermittel und Rohstoffe
• Milcherzeugnisse — mit dem Hinweis, dass sie das Auffangen des Gases im Durham-Röhrchen erschweren können (5 Röhrchen je Verdünnung zulässig)
• Ergänzung der Plattenverfahren (ISO 16649) bei einem erwarteten Niveau unterhalb ihrer Bestimmungsgrenze

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-ISO 7251:2006 (ISO 7251:2005)

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby przypuszczalnych Escherichia coli — Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli — Most probable number technique

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probe

   Bereite die Probe, die Erstverdünnung und die Zehnerverdünnungen nach ISO 6887-1 bis -4 (Milch: ISO 8261) oder nach der Produktnorm vor.

2. Beimpfung der Laurylsulfat-Bouillon

   Nachweis: eine festgelegte Menge der Erstverdünnung in ein Röhrchen mit der Bouillon. Zahlbestimmung: je drei Röhrchen mit doppelt und mit einfach konzentrierter Bouillon mit einer festgelegten Menge der Erstverdünnung sowie je drei Röhrchen mit einfach konzentrierter Bouillon mit den weiteren Zehnerverdünnungen.

3. Bebrütung bei 37 °C

   Bebrüte bis zu 48 h bei 37 °C; prüfe die Gasbildung nach 24 h und 48 h (bei Milcherzeugnissen kann das Auffangen des Gases erschwert sein).

4. Überimpfung in die EC-Bouillon

   Überimpfe aus jedem doppelt konzentrierten Röhrchen mit Trübung oder Gas und aus jedem einfach konzentrierten Röhrchen mit Gas mit der Impföse in die EC-Bouillon; bebrüte bei 44 °C bis zu 48 h und prüfe das Gas nach 24 h und 48 h.

5. Indol-Test

   Überimpfe aus den EC-Röhrchen mit Gas in Peptonwasser ohne Indol, bebrüte 48 h bei 44 °C und gib das Kovacs-Reagenz zu — die Bildung von Indol (Farbe) zeigt präsumtive E. coli an.

6. Ergebnis

   Nachweis: Anwesenheit/Fehlen präsumtiver E. coli in x g oder x ml. Zahlbestimmung: Lies aus der Zahl der einfach und doppelt konzentrierten Röhrchen, deren Überimpfungen Gas in der EC-Bouillon und Indol ergaben, die MPN aus der Tabelle des Anhangs A ab (Berechnung nach ISO 7218); berücksichtige im Prüfbericht die Streuung des Verfahrens und die Abweichungen.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Kulturen von E. coli können krankheitserregende Stämme umfassen — Arbeit in einem mikrobiologischen Labor, Autoklavieren der Abfälle
• Das Kovacs-Reagenz enthält konzentrierte HCl und Amylalkohole — Arbeit im Abzug, Schutz von Augen und Händen
• Bebrütung bei 44 °C — Kontrolle der Badtemperatur; Röhrchen mit Gas vorsichtig öffnen

Häufige Fragen