🍎 Herstellung von Fettsäuremethylestern (FAME) aus Ölen und Fetten — vier Verfahren: schnelle Umesterung mit KOH in Methanol (5.2), allgemeines alkalisch-saures Verfahren (5.3), BF3 (5.4) und säurekatalysierte Umesterung (5.5), PN-EN ISO 12966-2

Lebensmittelchemie PN-EN ISO 12966-2

Übersicht

WAS DIE NORM BESCHREIBT. Wir haben eine Leseprobe von ISO 12966-2:2017 (zweite Ausgabe) — vom Inhaltsverzeichnis bis zum Anfang von 5.2.5 (Seite 3 von 15); PN-EN ISO 12966-2:2017-05 übernimmt den Text unverändert (IDT). Anwendungsbereich (Abschnitt 1): Verfahren zur Herstellung von Fettsäuremethylestern aus tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen, Fettsäuren und Seifen — vier Methylierungsverfahren: (a) „schnelle" Umesterung unter alkalischen Bedingungen, (b) „allgemeine" Umesterung/Methylierung unter nacheinander alkalischen und sauren Bedingungen, (c) Umesterung mit BF3, (d) alternative säurekatalysierte Umesterung von Glyceriden. Die Ester dienen der Gaschromatographie (GLC), der Dünnschichtchromatographie (DC/TLC) und der Infrarotspektrometrie (IR). Milch und Milcherzeugnisse (und daraus stammendes Fett) sind vom Anwendungsbereich AUSGENOMMEN — laut Vorwort die einzige Änderung gegenüber der Ausgabe 2011.

WARUM ESTER UND WELCHES VERFAHREN (Einleitung und Abschnitt 4). Triacylglycerine sind zu wenig flüchtig und freie Fettsäuren chromatographieren schlecht, daher werden vor der GC Methylester gebildet; unvollständige Umsetzung, Veränderungen der Struktur der Säuren (Stellungs- und geometrische Isomere) und Artefakte, die keine FAME sind, verändern das Ergebnis der Zusammensetzung. Die Umesterung ist reversibel — sie erfordert einen großen Methanolüberschuss, und Wasser erschwert ihren Abschluss; alkalische Verfahren bilden aus freien Säuren keine FAME (es entstehen Seifen). Das schnelle Verfahren (5.2) eignet sich für Routineanalysen von Speiseölen und -fetten mit Säuren ab Buttersäure (C4:0) und für die Bestimmung von Butter- und Capronsäure mit innerem Standard, verestert aber keine freien Säuren; die Norm empfiehlt es nur bei einem Gehalt an freien Fettsäuren ≤ 0,5 % (m/m), das allgemeine Verfahren (5.3) oberhalb von 0,5 %; teilweise hydrolysiertes Fett lässt sich nach Verfahren 5.5 in FAME überführen. Das allgemeine Verfahren eignet sich für alle Öle und Fette, auch Destillate und saure Öle, wird aber für Laurinöle nicht empfohlen — kurzkettige Ester gehen beim Erhitzen unter Rückfluss verloren. BF3 — wegen seiner Toxizität nur „als letztes Mittel", nicht für Milchfette; hohe BF3-Konzentrationen (50 %) erzeugen Methoxy-Artefakte aus ungesättigten Säuren, das Reagenz ist begrenzt haltbar (im Kühlschrank lagern), und jede neue Charge wird vor Gebrauch geprüft. Keto-, Epoxy-, Hydroxy- und Hydroperoxygruppen, Cyclopropyl- und Cyclopropenylringe sowie acetylenische Säuren können sich bei der Methylierung zersetzen. Bei BF3 ergibt Isooctan die beste Wiederfindung der Ester, Capronsäuremethylester wird jedoch nur zu etwa 75 % wiedergefunden. Kurzkettige Ester gehen durch Flüchtigkeit (Erhitzen unter Rückfluss), Wasserlöslichkeit (wässrige Extraktion) und beim Abdampfen des Lösemittels verloren; Anhang A gibt einen einfachen DC-Test auf Vollständigkeit der Derivatisierung.

DAS SCHNELLE VERFAHREN — WAS DIE LESEPROBE ENTHÄLT (5.2). Prinzip: die Ester entstehen durch Umesterung mit methanolischer Kaliumhydroxidlösung; freie Säuren werden nicht verestert. Reagenzien: Methanol mit höchstens 0,5 % Wasser, Wasser der Qualität 3 nach ISO 3696, wasserfreies Natriumhydrogensulfat, Isooctan (2,2,4-Trimethylpentan) chromatographischer Reinheit, methanolische KOH etwa 2 mol/l (13,1 g KOH mit einem Gehalt von 85 g/100 g auf 100 ml wasserfreies Methanol, unter leichtem Erwärmen lösen), innerer Standard — Valeriansäuremethylester (Methylpentanoat, 250 mg in einem 50-ml-Kolben Isooctan; Bezugslösung 10 ml auf 100 ml) — nur für die Bestimmung von Butter- und Capronsäure, und NaCl-Lösung (40 g in 100 ml Wasser). Jede neue Reagenzcharge wird durch Herstellung des Esters reiner Ölsäure geprüft — zusätzliche Peaks schließen das Reagenz aus. Geräte: 10-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss mit PTFE-Dichtung, Pipetten nach ISO 8655-2, 3-ml-Fläschchen, Messkolben der Klasse A nach ISO 1042. Anmerkung zu 5.2.1: ein ähnliches Verfahren wird nach COI/T.20/Doc. No. 24:2001 für Olivenöl (natives mit einem Säuregehalt unter 3,3 %, raffiniertes, gemischtes) und für Oliventresteröl angewandt. Der Ablauf beginnt mit einer Einwaage von etwa 0,1 g im 10-ml-Röhrchen — danach bricht die Leseprobe ab.

STATUS (Stand der Karten am 29.09.2026). Die Karte PN-EN ISO 12966-2:2017-05 (polnische Fassung) hat keinen Vermerk „Zurückgezogen" — die Norm ist GÜLTIG: Veröffentlichung der polnischen Fassung am 14-11-2022, 24 Seiten, Preisgruppe M, Sektor Lebensmittel, Landwirtschaft und Forstwirtschaft, KT 92 Ölsaaten, pflanzliche und tierische Fette und deren Nebenprodukte, ICS 67.200.10, „Übernimmt: EN ISO 12966-2:2017 [IDT], ISO 12966-2:2017 [IDT]", „Ersetzt: PN-EN ISO 12966-2:2011 - englische Fassung". Die Karte der englischen Fassung derselben Ausgabe: veröffentlicht am 17-05-2017, 30 Seiten, Preisgruppe P, dasselbe Feld „Anwendungsbereich". Die Karte PN-EN ISO 12966-2:2011 (englische Fassung): „Zurückgezogen und ersetzt durch PN-EN ISO 12966-2:2017-05", veröffentlicht am 31-03-2011, „Datum der Zurückziehung: 17-05-2017", 17 Seiten, „Ersetzt: PN-EN ISO 5509:2001 - polnische Fassung". ISO 12966-2:2017 wurde 2022 überprüft und bestätigt (Seite der Norm bei ISO).

WIE VIELE LABORATORIEN UND IN WELCHER SCHREIBWEISE (Kopie der Datenbank der Akkreditierungsumfänge, Datenstand bis 17.09.2026, gelesen am 29.09.2026). Alle Schreibweisen der Nummer 12966-2: 19 Positionen bei 11 Laboratorien. „PN-EN ISO 12966-2:2017-05" — 10 Laboratorien, „PN-EN ISO 12966-2" ohne Jahr — AB 444. Viele Laboratorien beschränken die Norm auf ein oder zwei Verfahren (die Vermerke stehen bei der Normnummer sowohl in den PCA-Dokumenten als auch in der Datenbank des Dienstes): nur das schnelle Verfahren 5.2 — AB 539 („ausgenommen Punkte 5.3; 5.4; 5.5") und AB 1179 („Punkt 5.2"); nur das allgemeine Verfahren 5.3 — AB 819 („Punkt 5.3"); 5.2 und 5.3 — AB 565 („P. 5.2, P. 5.3") und AB 1679 („ausgenommen Punkte 5.4 und 5.5"); nur BF3 (5.4) — AB 562 („ausgenommen Punkte 5.2, 5.3 und 5.5", drei Positionen); die ganze Norm — AB 343, AB 444, AB 515, AB 552 und AB 775. Der Reiter „Laboratorien" sucht Schreibweisen, die MIT „PN-EN ISO 12966-2" BEGINNEN, und zeigt alle 11 Laboratorien — geprüft mit der Abfrage des Reiters auf dem Produktivserver labcoda.pl am 29.09.2026: 11. Aktuelle Umfänge auf den PCA-Seiten (gelesen am 29.09.2026, Ausgaben vom 03.11.2025 bis 18.09.2026): alle Positionen stehen in gültigen Ausgaben, jedes Zahlenpaar der Bereiche aus der Kopie kommt im aktuellen Dokument vor, und keine Position ist ausgesetzt (die Fußnoten zur Aussetzung im Umfang von AB 1179 betreffen andere Positionen).

GEGENSTAND UND GRÖSSEN. Erucasäure — AB 343 (pflanzliche Öle und Fette, Säuglingsnahrung, Senf), AB 539 (Öle), AB 552 (Öle, Lebensmittel für besondere Ernährungszwecke, Senf), AB 562 (Öle und Fette, Säuglingsnahrung), AB 565 (Speisefette) und AB 775 (Rapssamen) — Bereiche von (0,1 – 1,5) % (AB 343, Säuglingsnahrung) bis (10,0 – 55,0) % des Fettes (AB 552, Senf); AB 565 gibt seinen Bereich nur in g/kg an — (1,0 – 50,0) g/kg. Fettsäurezusammensetzung (ab C4:0 oder C6:0 aufwärts) — AB 444, AB 515, AB 819, AB 1179 und AB 1679 (auch flüssige Biokraftstoffe: Pflanzenöl), AB 562 — Omega-3-Säuren und Linolsäure. Technik überall: Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion (GC-FID). Die Position von AB 562 mit Omega-3-Säuren (BF3-Verfahren) umfasst im Gegenstand auch Milch und Milcherzeugnisse — die Ausgabe 2017 nimmt sie vom Anwendungsbereich der Norm aus, und die Einleitung schließt Milchfette vom BF3-Verfahren aus.

NEBEN DIESER NORM. In denselben Positionen: PN-EN ISO 12966-4:2015-07 (Bestimmung mittels Kapillargaschromatographie) — 9 Laboratorien (AB 343, AB 444, AB 515, AB 552, AB 562, AB 775, AB 819, AB 1179, AB 1679) und PN-EN ISO 12966-1:2015-01 (mit oder ohne Berichtigung AC:2015-06) — 8 (AB 515, AB 539, AB 552, AB 562, AB 775, AB 819, AB 1179, AB 1679); außerdem PN-ISO 1444:2000 — AB 343 (bei Ölen, Säuglingsnahrung und Senf), Prüfanweisungen IB-05 Ausg. 6 vom 12.05.2021 und IB-17 Ausg. 4 vom 10.03.2021 — AB 1179. PN-EN ISO 12966-1 hat in der Wissensdatenbank einen eigenen Eintrag. Die Karte PN-EN ISO 12966-4:2015-07 (polnische Fassung, Stand am 29.09.2026): „Zurückgezogen und ersetzt durch PN-EN ISO 12966-4:2026-08 - englische Fassung", Veröffentlichung der polnischen Fassung am 03-10-2022, „Datum der Zurückziehung: 31-08-2026", 28 Seiten, KT 92, im Feld „Zusätzliche Informationen": „Aktuell in der Konformitätsbewertung: 30-09-2026 - siehe Mitteilung des Präsidenten des PKN"; die Karte PN-EN ISO 12966-4:2026-08 (englische Fassung): veröffentlicht am 31-08-2026, 52 Seiten, „Übernimmt: EN ISO 12966-4:2026 [IDT], ISO 12966-4:2026 [IDT]", „Ersetzt" beide Fassungen der Ausgabe 2015-07. Acht dieser Laboratorien haben die Ausgabe 2015-07 im Umfang, AB 444 — eine Schreibweise ohne Jahr. Das Feld „Anwendungsbereich" der Karte 2015-07: ein Verfahren zur Bestimmung von FAME aus der Umesterung oder Veresterung von Fetten, Ölen und Fettsäuren mittels Kapillar-GLC, Trennung der Methylester von C8 bis C24 — gesättigter sowie cis- und trans-einfach- und mehrfach ungesättigter Fettsäuren; nicht für Fett aus Wiederkäuermilch und für mit konjugierter Linolsäure (CLA) angereicherte Erzeugnisse, Milch und Milcherzeugnisse außerhalb des Anwendungsbereichs, nicht für di-, tri-, polymerisierte und oxidierte Fettsäuren. Das Feld „Anwendungsbereich" der Karte 2026-08: Trennung der Ester von C4 bis C24 (ebenso: gesättigte sowie cis- und trans-einfach- und mehrfach ungesättigte Fettsäuren), auch aus Lebensmitteln extrahierte Fette; nicht für Milch und Milcherzeugnisse oder mit CLA angereicherte Erzeugnisse, nicht für di-, tri-, polymerisierte, hydroxylierte und oxidierte Fettsäuren; in Anhang E — FAME-Zusammensetzung als Flächen-% in flüssigen Pflanzenölen. Buttersäure (C4:0) bestimmen in diesen Positionen AB 444, AB 819 und AB 1179, Capronsäure (C6:0) als erste Säure der Liste AB 515 — alle mit Teil 4 in der Ausgabe 2015-07 (AB 444 ohne Jahr); in Teil 2 erfasst das schnelle Verfahren mit innerem Standard kurze Ketten (5.2); aus Teil 2 führt AB 1179 nur 5.2 an, AB 819 nur das allgemeine Verfahren 5.3, AB 444 und AB 515 die ganze Norm. Die Karte PN-ISO 1444:2000 (polnische Fassung): kein Vermerk „Zurückgezogen", „Fleisch und Fleischerzeugnisse — Bestimmung des Gehalts an freiem Fett", Extraktion des getrockneten Rückstands mit n-Hexan oder Petrolether, veröffentlicht am 14-06-2000, 7 Seiten, KT 93 Fleisch, Eier und deren Erzeugnisse, übernimmt ISO 1444:1996 [IDT]. Erucasäure ohne diese Norm bestimmen 8 Laboratorien, ausschließlich nach eigenen Prüfanweisungen (AB 311, AB 313, AB 377, AB 381, AB 438, AB 509, AB 591, AB 1275); alle diese Zeilen stehen in den aktuellen PCA-Umfängen ohne Aussetzung (gelesen am 29.09.2026).

WO MAN LEICHT EIN SCHEINBAR RICHTIGES ERGEBNIS ERHÄLT. Das schnelle Verfahren verestert keine freien Fettsäuren: das Ergebnis der Zusammensetzung beschreibt dann die in Glyceriden gebundenen Säuren, und die freien Säuren in der Lösung können zusätzliche Peaks ergeben und die Identifizierung der Ester erschweren (Abschnitt 4). Die Norm lässt die Annahme zu, dass freie Säuren dieselbe Verteilung haben wie die Triglyceride, jedoch meist nur in Rohölen — in raffinierten und fraktionierten Ölen kann es anders sein. Zweitens gehen kurze Ketten (C4–C6) beim Erhitzen, in Wasser und beim Abdampfen des Lösemittels verloren — und bei BF3 wird Capronsäuremethylester nur zu etwa 75 % wiedergefunden. Drittens erzeugt BF3 aus einer gealterten Charge oder in hoher Konzentration Artefakte — zusätzliche Peaks können für Fettsäuren gehalten werden.

WAS WIR NICHT ANGEBEN. Die Leseprobe endet am Anfang des Ablaufs des schnellen Verfahrens (5.2.5), daher nennen wir weder die weiteren Schritte des schnellen Verfahrens noch Reagenzien und Ablauf des allgemeinen (5.3), des BF3- (5.4) oder des säurekatalysierten Verfahrens (5.5), noch den DC-Test aus Anhang A. Die Bedingungen der chromatographischen Trennung nennt dieser Teil nicht — sie stehen in PN-EN ISO 12966-4.

Prinzip der Methode

Die in Acylglycerinen gebundenen Fettsäuren werden durch Umesterung in Methanol mit alkalischem Katalysator (KOH — schnelles Verfahren, ohne Veresterung freier Säuren), in zwei Stufen, alkalisch und sauer (allgemeines Verfahren, auch für freie Säuren), mit BF3 (Methylierung freier Säuren und Umesterung von Estern) oder mit saurem Katalysator (teilweise hydrolysierte Fette) in Methylester überführt. Die Ester werden mit Isooctan extrahiert und nach einem anderen Teil der Norm gaschromatographisch untersucht. Die Wahl des Verfahrens hängt vom Gehalt an freien Säuren (≤ 0,5 % — schnell, > 0,5 % — allgemein), von kurzen Ketten und labilen Gruppen ab; BF3 — nur als letztes Mittel.

Anwendungen

• Erucasäure in Ölen, Fetten, Rapssamen, Senf und Säuglingsnahrung — 6 Laboratorien
• Fettsäurezusammensetzung von Lebensmitteln, Ölen und Biokraftstoffen aus Pflanzenöl (ab C4:0) — 6 Laboratorien
• Herstellung von FAME für GC, DC und IR; ohne Milch und Milcherzeugnisse (vom Anwendungsbereich der Ausgabe 2017 ausgenommen)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 12966-2:2017-05 (wersja polska z 14-11-2022 i wersja angielska; EN ISO 12966-2:2017, ISO 12966-2:2017 IDT)

Titel (PL)

Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce — Chromatografia gazowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych — Część 2: Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych

Title (EN)

Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Wahl des Verfahrens

   Gehalt an freien Fettsäuren ≤ 0,5 % — schnelles Verfahren (5.2); > 0,5 % — allgemeines (5.3); teilweise hydrolysiertes Fett — 5.5; BF3 (5.4) nur als letztes Mittel; Milch und Milcherzeugnisse außerhalb des Anwendungsbereichs.

2. Prüfung der Reagenzien

   Jede neue Charge von Reagenz oder Lösemittel wird am Ester reiner Ölsäure geprüft — unerwartete Peaks schließen das Reagenz aus.

3. Laborprobe

   Nach ISO 661; festes Fett wird knapp über seinen Schmelzpunkt erwärmt (5.1).

4. Schnelles Verfahren — Beginn

   Etwa 0,1 g Probe in einem 10-ml-Schraubverschlussröhrchen; bei Bestimmung mit innerem Standard — genaue Einwaage; die weiteren Schritte liegen außerhalb der Leseprobe — GEBEN WIR NICHT AN.

5. Chromatographie

   Ester in Isooctan zur GC nach einem anderen Teil der Norm (PN-EN ISO 12966-4); diesen Teil GEBEN WIR NICHT AN.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Methanolische Kaliumhydroxidlösung ist giftig und ätzend — Augenschutz und Schutz vor Verätzungen (Warnhinweis in Abschnitt 5)
• Isooctan ist entzündbar und beim Verschlucken und Einatmen giftig, Explosionsgrenzen 1,1–6,0 % Vol.; BF3 — giftig, nur als letztes Mittel; Arbeiten unter einem funktionierenden Abzug

Häufige Fragen