🦠 Gesamtkeimzahl in Lebensmitteln und Futtermitteln — Oberflächenverfahren auf PCA bei 30 °C (72 h)

Mikrobiologie PN-EN ISO 4833-2

Übersicht

ISO 4833-2:2013 legt ein horizontales Verfahren zur Zählung der Mikroorganismen fest, die nach aerober Bebrütung bei 30 °C auf der Oberfläche eines festen Nährmediums wachsen und Kolonien bilden können. Es wird für Erzeugnisse angewendet, die zum Verzehr durch den Menschen oder zur Verfütterung bestimmt sind, sowie für Umgebungsproben aus der Herstellung von und dem Verkehr mit Lebensmitteln und Futtermitteln. Das Oberflächenverfahren ist angezeigt für Erzeugnisse, die hitzeempfindliche Organismen als bedeutenden Teil der Flora enthalten (z. B. Psychrotrophe in gekühlten und gefrorenen Lebensmitteln, getrocknete Lebensmittel), für Erzeugnisse mit obligat aeroben Bakterien (z. B. Pseudomonas spp.), für Erzeugnisse mit feinen Partikeln, die sich im Plattengussverfahren nur schwer von Kolonien unterscheiden lassen, für Erzeugnisse mit intensiver Färbung, die das Erkennen der Kolonien erschwert, sowie dann, wenn die Qualitätsbeurteilung eine Unterscheidung der Koloniearten erfordert. Neben dem manuellen Oberflächenverfahren beschreibt die Norm die Verwendung eines Spiralplattengeräts — eines schnellen Verfahrens zum Zählen der Oberflächenkolonien (Anhang A).

Teil 1 der Norm (ISO 4833-1) ist das Plattengussverfahren bei 30 °C — auf dieses verweist die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 in den Prozesshygienekriterien (Zahl der aeroben Bakterien in Schlachtkörpern, Hackfleisch). In Polen gilt sie als PN-EN ISO 4833-2:2013-12 (polnische Fassung von 2017; sie ersetzte PN-EN ISO 4833:2004) mit der Änderung A1:2022-06. Schema des Verfahrens in den Materialien des PIWet-PIB: Einwaage x g oder x ml → Erstverdünnung in 9x Verdünnungsmittel → Beimpfung des PCA → Bebrütung bei 30 °C für 72 ± 3 h → Ablesung → Auswertung → Angabe der Ergebnisse.

Prinzip der Methode

Eine festgelegte Menge der Probe (flüssiges Erzeugnis) oder der Erstverdünnung (andere Erzeugnisse) wird nach dem Oberflächenverfahren auf einen festen Agarnährboden in Petrischalen aufgebracht; weitere Platten werden unter denselben Bedingungen aus den Zehnerverdünnungen angelegt. Mit einer sterilen Pipette werden 0,1 ml der Probe oder der Erstverdünnung auf eine Platte übertragen, 0,1 ml der Verdünnung 10⁻¹ (flüssige Erzeugnisse) oder 10⁻² (andere Erzeugnisse) mit einer neuen Pipette auf die nächste, und erforderlichenfalls weitere Verdünnungen; die Bestimmungsgrenze lässt sich um das Zehnfache senken, indem 1,0 ml der Probe oder der Erstverdünnung aufgebracht wird. Das Inokulum wird gleichmäßig und möglichst rasch über die Agaroberfläche verteilt, die Platten werden mit den Deckeln etwa 15 min bei Umgebungstemperatur zum Einziehen stehen gelassen, umgedreht und 72 h bei 30 °C aerob bebrütet. Nach der Bebrütung werden die Platten ausgewählt, die nach Möglichkeit weniger als 300 Kolonien enthalten; schwärmende Kolonien werden als einzelne gezählt, und wenn sie zu erwarten sind, werden die Platten nach 24 h oder 48 h betrachtet und die sichtbaren Kolonien markiert. Die Keimzahl je Gramm oder Milliliter wird aus der Zahl der Kolonien auf den Platten mit weniger als 300 Kolonien berechnet. Das Nährmedium (Agar mit Hefeextrakt, PCA) hat nach der Sterilisation einen pH-Wert von 7,0 ± 0,2 bei 25 °C (Autoklav 121 °C, 15 min); bei der Untersuchung von Milcherzeugnissen wird Magermilchpulver 1,0 g/l zugesetzt; in die Platten werden 15–20 ml des Nährmediums gegossen, die Platten können bis zu 4 Wochen bei (5 ± 3) °C aufbewahrt werden, und vor der Verwendung wird ihre Oberfläche getrocknet (z. B. im Schrank bei 37–55 °C oder in der Reinluftwerkbank).

Anwendungen

• Gekühlte und gefrorene Lebensmittel mit hitzeempfindlicher psychrotropher Flora; getrocknete Lebensmittel
• Erzeugnisse mit obligat aeroben Bakterien (z. B. Pseudomonas spp.)
• Erzeugnisse mit feinen, von Kolonien schwer unterscheidbaren Partikeln oder mit intensiver Färbung, bei denen das Plattengussverfahren die Ablesung erschwert
• Qualitätsbeurteilung, die eine Unterscheidung der Koloniearten erfordert; Futtermittel und Umgebungsproben
• Laboratorien mit hohem Durchsatz — Spiralverfahren (Anhang A)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 4833-2:2013-12 + A1:2022-06 (ISO 4833-2:2013 + Amd 1:2022)

Titel (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów — Część 2: Oznaczanie liczby metodą posiewu powierzchniowego w temperaturze 30 °C

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 2: Colony count at 30 °C by the surface plating technique

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Herstellung der Platten

   Stelle PCA her (für Milcherzeugnisse mit 1,0 g/l Magermilch), stelle den pH-Wert so ein, dass er nach der Sterilisation (121 °C, 15 min) 7,0 ± 0,2 beträgt, kühle im Wasserbad auf 47–50 °C ab, gieße 15–20 ml in sterile Platten und lasse sie erstarren (Aufbewahrung ≤ 4 Wochen bei (5 ± 3) °C). Trockne die Oberfläche vor der Beimpfung.

2. Erstverdünnung und Verdünnungen

   Stelle aus der Einwaage von x g oder x ml eine Erstverdünnung in 9x Verdünnungsmittel und die Zehnerverdünnungen her.

3. Beimpfung

   Übertrage mit einer sterilen Pipette 0,1 ml der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung auf eine Platte; mit einer neuen Pipette 0,1 ml der Verdünnung 10⁻¹ (Flüssigkeiten) oder 10⁻² (andere Erzeugnisse) auf die nächste; erforderlichenfalls weitere Verdünnungen. Bringe zur Senkung der Grenze um das Zehnfache 1,0 ml auf.

4. Verteilen

   Verteile das Inokulum mit dem Spatel gleichmäßig und möglichst rasch über die gesamte Agaroberfläche; lasse die Platten mit den Deckeln etwa 15 min bei Umgebungstemperatur zum Einziehen stehen.

5. Bebrütung

   Drehe die Platten um und bebrüte sie im Brutschrank 72 h bei 30 °C.

6. Zählung

   Wähle die Platten mit (nach Möglichkeit) weniger als 300 Kolonien aus. Zähle schwärmende Kolonien als einzelne; wenn sie zu erwarten sind, betrachte die Platten nach 24 h oder 48 h und markiere die sichtbaren Kolonien.

7. Ergebnis

   Berechne die Keimzahl je Gramm oder Milliliter der Probe und gib das Ergebnis nach der Norm an.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Kulturen der Mischflora aus Lebensmitteln — aseptisches Arbeiten, Autoklavieren der gebrauchten Platten
• Geschmolzener Agar bei 47–50 °C und der Autoklav — Verbrennungsgefahr
• Spiralplattengerät — Desinfektion des Dosiersystems nach der Anleitung des Herstellers

Häufige Fragen