🧫 Gesamtkeimzahl bei 36°C
Bestimmung der Gesamtkoloniezahl von Mikroorganismen, die bei 36±2°C nach 44±4 h wachsen, mittels Gussplattenverfahren in Hefeextrakt-Agar. Indikator für potenziell pathogene Mikroorganismen im Wasser.
Übersicht
Die Gesamtkeimzahl bei 36°C (HPC 36 — Heterotrophic Plate Count bei 36°C) ist ein ergänzender Parameter zur Bestimmung bei 22°C und liefert andere diagnostische Informationen. Mikroorganismen, die bei einer Temperatur von 36±2°C (nahe der Körpertemperatur) wachsen, sind Organismen, die potenziell menschlichen oder tierischen Ursprungs sind und sich besser an die Bedingungen warmblütiger Wirte anpassen. Ihr Vorhandensein im Trinkwasser hat eine größere hygienische Bedeutung als Mikroorganismen bei 22°C.
Eine erhöhte Koloniezahl bei 36°C im Vergleich zu 22°C kann auf frische Kontamination des Wassers mit biologischem Material menschlichen oder tierischen Ursprungs, unwirksame Desinfektion oder Kontamination des Wasserversorgungsnetzes hindeuten. Das Ergebnis wird zusammen mit der Bestimmung bei 22°C interpretiert — das Verhältnis HPC 36°C / HPC 22°C liefert wertvolle Informationen über die Art der Kontamination.
Das Analyseverfahren ist identisch mit der Bestimmung bei 22°C — Gussplattenverfahren auf YEA-Agar — mit dem Unterschied, dass die Inkubation bei einer Temperatur von 36±2°C für 44±4 Stunden (ca. 2 Tage) durchgeführt wird. Die kürzere Inkubationszeit ergibt sich aus dem schnelleren Wachstum mesophiler Bakterien bei ihrer optimalen Temperatur.
Der Parameter ist bei der Trinkwasseruntersuchung gemäß Gesundheitsministerium-Verordnung obligatorisch. Normwert: „keine abnormalen Veränderungen". In der Laborpraxis Referenzwert: <20 KBE/mL in aufbereitetem Wasser, bis zu 100 KBE/mL im Netz.
Prinzip der Methode
Identisches Prinzip wie bei der Bestimmung bei 22°C (Gussplatte): 1 mL Wasserprobe wird in eine sterile Petrischale gemessen, mit 15–20 mL geschmolzenem und auf 44–47°C abgekühltem Hefeextrakt-Agar (YEA) übergossen. Nach Erstarren wird bei 36±2°C für 44±4 h inkubiert. Die Temperatur von 36°C liegt nahe der menschlichen Körpertemperatur, was das Wachstum mesophiler Bakterien — potenziell pathogener oder indikativer — begünstigt. Kolonien werden auf der Oberfläche und innerhalb des Agars gezählt.
Anwendungen
- Kontrolle der Trinkwasserqualität (Indikatorparameter gem. Gesundheitsministerium-Verordnung)
- Bewertung des hygienischen Risikos — Nachweis mesophiler Bakterien
- Überwachung der Wirksamkeit der Wasserdesinfektion (Chlorierung, UV)
- Kontrolle von Flaschenwasser — Veränderungen während der Lagerung
- Untersuchung von Wasser in Krankenhäusern und Gesundheitseinrichtungen
- Überwachung von Schwimmbadwasser
- Vergleich mit dem Verhältnis HPC 36°C / HPC 22°C — Diagnostik der Kontaminationsquelle
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Ergebnis | KBE/1 mL (koloniebildende Einheiten) |
| Kriterium (Trinkwasser) | Keine abnormalen Veränderungen (praktisch: <20 KBE/mL) |
| Inkubationstemperatur | 36 ± 2°C |
| Inkubationszeit | 44 ± 4 Stunden (ca. 2 Tage) |
| Probenvolumen | 1 mL (Gussplatte) |
| Medium | Hefeextrakt-Agar (YEA) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 6222:2004
- Titel (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów zdolnych do wzrostu — Oznaczanie ogólnej liczby kolonii metodą posiewu w agarze odżywczym
- Title (EN)
- Water quality — Enumeration of culturable micro-organisms — Colony count by inoculation in a nutrient agar culture medium
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. YEA-Medium-Herstellung
YEA-Agar gemäß Herstelleranleitung lösen. Im Autoklav bei 121°C/15 min sterilisieren. Im Wasserbad bei 44–47°C halten (max. 4 Stunden).
2. Probenvorbereitung
Probe vorsichtig mischen (25 Umkehrungen der Flasche). Chlor bei Vorhandensein mit Natriumthiosulfat neutralisieren.
3. Gussplattenausstrich
1 mL Probe mit Pipette in sterile Petrischale messen (Doppelbestimmung). Bei Proben mit vermuteter hoher Kontamination: Verdünnungen 10⁻¹, 10⁻² herstellen.
4. Übergießen mit YEA-Agar
Sofort mit 15–20 mL geschmolzenem YEA (44–47°C) übergießen. Durch vorsichtige Drehbewegung mischen (Achterfigur). Keine Blasen erzeugen.
5. Erstarrung
Schalen auf ebener Fläche bis zum Erstarren stehen lassen (15–20 min). Schalen vor dem Erstarren nicht bewegen.
6. Inkubation 36°C
Umgedrehte Schalen im Brutschrank bei 36±2°C aufstellen. 44±4 Stunden inkubieren (ca. 2 Tage).
7. Ergebnisablesung
Alle Kolonien (Oberflächen- und Tiefenkolonien) mit Lupe oder automatischem Zähler zählen. Optimaler Bereich: 15–300 Kolonien pro Schale.
8. Ergebnisberechnung
Ergebnis = Mittelwert aus Doppelbestimmungen × Verdünnungsfaktor. Angabe in KBE/1 mL. Auf 2 signifikante Stellen runden. Z. B. 127 → 130 KBE/mL.
9. Diagnostische Interpretation
Ergebnis mit HPC bei 22°C vergleichen. Verhältnis HPC 36°C / HPC 22°C > 1 deutet auf frische Kontamination von außen hin. HPC 36°C / HPC 22°C < 1 — typisch für Vermehrung der natürlichen Wasserflora.
10. Qualitätskontrolle und Entsorgung
Negativkontrolle: Schale nur mit Agar. Temperaturkontrolle: Registriergerät im Brutschrank. Schalen nach Ablesung autoklavieren 121°C/30 min.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Brutschrank 36°C | Binder BD 56, Memmert IN30, Pol-Eko CLN 32 | 5 000–15 000 PLN |
| Wasserbad 44–47°C | Memmert WNB 7, Julabo TW2 | 3 000–8 000 PLN |
| Autoklav | Tuttnauer ELV 2540, Systec VX-40 | 20 000–45 000 PLN |
| Automatische Pipetten 1 mL | Eppendorf Research Plus 100–1000 µL, Gilson Pipetman L | 800–2 500 PLN/Stk. |
| Sterile Petrischalen 90 mm | Polystyrol, Einweg, steril. Citotest, Gosselin | 150–300 PLN/Packung (500 Stk.) |
| Lupe / Kolonienzähler | Stuart SC6+, Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Hefeextrakt-Agar (YEA) | — | Yeast Extract Agar: Pepton 5 g/L, Hefeextrakt 2,5 g/L, Glucose 1 g/L, Agar 9–18 g/L. Hersteller: Merck, Oxoid, Biokar |
| Natriumthiosulfat (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Zur Neutralisierung von Chlor in Leitungswasserproben, 1,8 %-Tabletten |
| Gepuffertes Peptonwasser | — | Zur Verdünnung von Proben, sterile 9-mL-Röhrchen, 0,1 % Pepton + 0,85 % NaCl |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Wasserproben können mesophile Krankheitserreger enthalten — Nitrilhandschuhe, Laborkittel, Schutzbrille
- Geschmolzener Agar (44–47°C) — Verbrennungsgefahr beim Gießen der Schalen
- Mesophile Kolonien können opportunistische Krankheitserreger enthalten — vor Entsorgung autoklavieren
- Vorsicht bei der Arbeit mit Bunsenbrenner — offene Flamme im Labor