🧫 Gesamtkeimzahl bei 22°C
Bestimmung der Gesamtkoloniezahl von Mikroorganismen, die bei 22±2°C nach 68±4 h wachsen, mittels Gussplattenverfahren in Hefeextrakt-Agar. Indikator für die Trinkwasserqualität.
Übersicht
Die Gesamtkeimzahl bei 22°C (HPC 22 — Heterotrophic Plate Count) ist ein grundlegender mikrobiologischer Parameter von Trinkwasser, der den allgemeinen hygienischen Zustand des Wassers und die Wirksamkeit der Aufbereitungsprozesse widerspiegelt. Das Ergebnis wird als Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) in 1 mL Probe ausgedrückt.
Mikroorganismen, die bei einer Temperatur von 22±2°C nach 68±4 Stunden wachsen, sind hauptsächlich umweltbedingte (autochthone) Bakterien, die natürlicherweise in Wasser und Boden vorkommen. Dazu gehören Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium, Caulobacter, Arthrobacter und andere. Ihr Vorhandensein im Trinkwasser in mäßigen Mengen ist natürlich, jedoch kann ein plötzlicher Anstieg der Keimzahl auf Folgendes hindeuten: sekundäre Netzverunreinigung, Wasserstagnation, Rohrschäden, Biofilmbildung oder unwirksame Desinfektion.
Die Methode nach PN-EN ISO 6222:2004 besteht aus dem Gussplattenverfahren — ein abgemessenes Probenvolumen (1 mL) wird in eine sterile Petrischale gegeben, mit geschmolzenem und abgekühltem Hefeextrakt-Agar (YEA — Yeast Extract Agar) übergossen, vorsichtig gemischt und nach Erstarren bei 22±2°C für 68±4 Stunden inkubiert. Kolonien wachsen sowohl auf der Oberfläche als auch innerhalb des Agars.
Normwert für Trinkwasser: keine numerischen Anforderungen in der Gesundheitsministerium-Verordnung, jedoch wird „keine abnormalen Veränderungen" gefordert. In der Praxis gilt: <100 KBE/mL wird als akzeptabel angesehen, >200 KBE/mL — Warnsignal.
Prinzip der Methode
Gussplattenverfahren: 1 mL Wasserprobe wird mit einer Pipette in eine sterile Petrischale gemessen, dann mit 15–20 mL geschmolzenem und auf 44–47°C abgekühltem Hefeextrakt-Agar (Yeast Extract Agar — YEA) übergossen. Die Probe wird durch vorsichtige Drehbewegung mit dem Agar gemischt. Nach Erstarren des Mediums wird bei 22±2°C für 68±4 Stunden inkubiert. Mikroorganismen, die unter diesen Bedingungen wachsen können, bilden mit bloßem Auge sichtbare Kolonien, die mit Lupe oder automatischem Zähler gezählt werden.
Anwendungen
- Kontrolle der Trinkwasserqualität (Indikatorparameter gem. Gesundheitsministerium-Verordnung)
- Überwachung des Wasserversorgungsnetzes — Erkennung sekundärer Kontamination
- Bewertung der Wirksamkeit des Wasseraufbereitungsprozesses
- Kontrolle von Flaschen- und Quellwasser
- Untersuchung von Schwimmbadwasser
- Überwachung von Grundwasserentnahmen
- Bewertung der Wasserstagnation in internen Installationen
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Ergebnis | KBE/1 mL (koloniebildende Einheiten) |
| Kriterium (Trinkwasser) | Keine abnormalen Veränderungen (praktisch: <100 KBE/mL) |
| Inkubationstemperatur | 22 ± 2°C |
| Inkubationszeit | 68 ± 4 Stunden (ca. 3 Tage) |
| Probenvolumen | 1 mL (Gussplatte) |
| Medium | Hefeextrakt-Agar (YEA) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 6222:2004
- Titel (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów zdolnych do wzrostu — Oznaczanie ogólnej liczby kolonii metodą posiewu w agarze odżywczym
- Title (EN)
- Water quality — Enumeration of culturable micro-organisms — Colony count by inoculation in a nutrient agar culture medium
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. YEA-Medium-Herstellung
YEA-Agar in destilliertem Wasser lösen. Im Autoklav bei 121°C/15 min sterilisieren. Nach Sterilisation im Wasserbad bei 44–47°C halten (max. 4 Stunden).
2. Probenvorbereitung
Wasserprobe vorsichtig mischen (Flasche 25-mal umdrehen). Bei Chlorgehalt Thiosulfat-Tablette verwenden.
3. Gussplattenausstrich
1 mL Probe mit Pipette in sterile Petrischale messen. Für Verdünnungen: 1 mL in 9 mL Peptonwasser, wiederholen.
4. Übergießen mit Agar
Probe mit 15–20 mL geschmolzenem YEA (44–47°C) übergießen. Sofort durch vorsichtige Drehbewegung mischen (Achterfigur). Blasen vermeiden.
5. Erstarrung
Schalen auf ebener Fläche bis zum vollständigen Erstarren des Agars stehen lassen (ca. 15–20 min). Doppelbestimmung für jede Probe durchführen.
6. Inkubation 22°C
Umgedrehte Schalen (Boden nach oben) im Brutschrank bei 22±2°C aufstellen. 68±4 Stunden inkubieren (ca. 3 Tage). Brutschrank nicht unnötig öffnen.
7. Ergebnisablesung
Alle sichtbaren Kolonien (Oberflächen- und Tiefenkolonien) mit beleuchteter Lupe oder automatischem Zähler zählen. Optimale Anzahl: 15–300 Kolonien pro Schale.
8. Ergebnisberechnung
Ergebnis = arithmetisches Mittel aus Doppelbestimmungen × Verdünnungsfaktor. Angabe in KBE/1 mL. Auf zwei signifikante Stellen runden.
9. Qualitätskontrolle
Negativkontrolle: Schale nur mit Agar (Mediensterilität). Doppelbestimmung alle 10 Proben. Brutschranktemperaturkontrolle (Registriergerät).
10. Entsorgung
Schalen nach Ablesung autoklavieren 121°C/30 min. Als infektiösen Abfall entsorgen.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Brutschrank 22°C | Binder KB 53, Memmert IPP 110, Pol-Eko CLW 53 (mit Kühlung) | 8 000–20 000 PLN |
| Wasserbad 45–47°C | Memmert WNB 7, Julabo TW2 — zum Warmhalten des geschmolzenen Agars | 3 000–8 000 PLN |
| Autoklav | Tuttnauer ELV 2540, Systec VX-40 | 20 000–45 000 PLN |
| Automatische Pipetten 1 mL | Eppendorf Research Plus 100–1000 µL, Gilson Pipetman L | 800–2 500 PLN/Stk. |
| Sterile Petrischalen 90 mm | Polystyrol, Einweg, steril. Citotest, Gosselin | 150–300 PLN/Packung (500 Stk.) |
| Lupe / Kolonienzähler | Stuart SC6+, Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Hefeextrakt-Agar (YEA) | — | Yeast Extract Agar: Pepton 5 g/L, Hefeextrakt 2,5 g/L, Glucose 1 g/L, Agar 9–18 g/L. Hersteller: Merck, Oxoid, Biokar |
| Natriumthiosulfat (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Zur Neutralisierung von Chlor in Leitungswasserproben |
| Gepuffertes Peptonwasser | — | Zur Verdünnung von Proben, sterile 9-mL-Röhrchen |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Wasserproben können Krankheitserreger enthalten — Nitrilhandschuhe, Laborkittel, Schutzbrille
- Geschmolzener Agar (44–47°C) — Verbrennungsgefahr. Hitzebeständige Handschuhe verwenden
- Kolonien auf Platten als potenziell infektiös behandeln — vor Entsorgung autoklavieren
- Arbeit mit Bunsenbrenner — Vorsicht walten lassen, nicht unbeaufsichtigt lassen