🦠 Microcystine (Cyanotoxine) im Wasser — Festphasenextraktion und HPLC mit UV-Detektion bei 238 nm

Mikrobiologie ISO 20179

Übersicht

Microcystine sind von Cyanobakterien gebildete Toxine; die Norm beginnt mit der Warnung, dass sie für den Menschen stark lebertoxisch sind. Die Bezeichnungen der Varianten stammen von zwei veränderlichen Aminosäuren: MCYST-LR enthält Leucin (L) und Arginin (R), MCYST-RR zwei Arginin-Einheiten und MCYST-YR Tyrosin (Y) und Arginin. Für Microcystin-LR hat die Weltgesundheitsorganisation einen Schwellenwert von 1 µg/l im Wasser vorgeschlagen; die Norm gibt an, dass sich dieser Wert nach der Anreicherung der Probe mittels SPE überwachen lässt.

ISO 20179:2005 beschreibt die Bestimmung und die mengenmäßige Ermittlung von Microcystinen in Rohwasser, das Biomasse enthält, sowie in aufbereitetem Wasser wie Leitungswasser. Das Verfahren ist für drei Varianten validiert: MCYST-RR, MCYST-YR und MCYST-LR. Es kann auch auf einige andere Strukturvarianten dieser Microcystine angewendet werden, deren eindeutige Identifizierung jedoch nicht möglich ist — es fehlen handelsübliche Normale und die Peaks koeluieren. Im Anhang A lässt die Norm die Massenspektrometrie als alternative Detektion zu.

In Polen ist Microcystin-LR ein chemischer Parameter des für den menschlichen Gebrauch bestimmten Wassers: die Verordnung des Gesundheitsministers vom 22. Mai 2026 (Gesetzblatt 2026 Pos. 748) legt einen Parameterwert von 1,0 µg/l fest, mit dem Hinweis, dass „parametr ten mierzy się jedynie w przypadku potencjalnych zakwitów w źródle wody (zwiększenie gęstości komórek sinicowych lub potencjał tworzenia zakwitu)" [dieser Parameter wird nur im Falle möglicher Blüten in der Wasserquelle gemessen (Zunahme der Dichte der Cyanobakterienzellen oder Blütenbildungspotenzial)], und setzt die zulässige Messunsicherheit auf 30 % des Parameterwertes fest. Die Verordnung gibt für diesen Parameter kein Referenzverfahren an — Referenzverfahren nennt sie nur für die mikrobiologischen Parameter. Die ISO 20179:2005 selbst ist nicht in den Bestand der Polnischen Normen übernommen worden; die erste Ausgabe bleibt geltend und wurde von ISO in einer am 7. April 2026 abgeschlossenen systematischen Überprüfung bestätigt (Stufe 90.93 „Internationale Norm bestätigt"). In der Lebenszyklus-Karte der Norm ist weder eine ersetzende Norm noch eine Berichtigung (Cor/Amd) vermerkt.

DER POLNISCHE TITEL IN DIESEM EINTRAG IST UNSERE ARBEITSÜBERSETZUNG, kein amtlicher Titel: die Norm ist nicht in den Bestand der Polnischen Normen übernommen worden.

Prinzip der Methode

Wasserproben, die Cyanobakterienmaterial (Biomasse) enthalten, werden zunächst filtriert. Die zurückgehaltene Biomasse wird gesondert mit einem Gemisch aus Methanol und Wasser extrahiert, der Extrakt filtriert, verdünnt und mittels Festphasenextraktion (SPE) gereinigt; das Filtrat nach der Abtrennung der Biomasse wird wie eine Probe reinen Wassers behandelt. Proben reinen Wassers, z. B. Leitungswasser, werden unmittelbar an einer SPE-Kartusche angereichert. Die Microcystine werden von der Kartusche mit einem Gemisch Methanol/Wasser 90/10 (v/v) eluiert, das 0,1 Vol.-% Trifluoressigsäure (TFA) enthält, und mittels Hochleistungsflüssigchromatographie mit Umkehrphase (RP-HPLC) mit Detektion im Ultraviolett / mit Diodenarray bei einer Wellenlänge von 238 nm mengenmäßig bestimmt.

Anwendungen

• Überwachung des für den menschlichen Gebrauch bestimmten Wassers während einer Cyanobakterienblüte in der Wasserquelle (Gesetzblatt 2026 Pos. 748: Parameterwert 1,0 µg/l für Microcystin-LR)
• Rohwasser aus Oberflächenfassungen — blütenanfällige Seen und Talsperren
• Beurteilung der Wirksamkeit der Wasseraufbereitung hinsichtlich der Entfernung von Cyanotoxinen
• Im Netz verteiltes Leitungswasser (Proben reinen Wassers werden unmittelbar an der SPE angereichert)
• Bestimmung der Varianten MCYST-RR und MCYST-YR neben MCYST-LR — das Verfahren ist für alle drei validiert

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

ISO 20179:2005

Titel (PL)

Jakość wody — Oznaczanie mikrocystyn — Metoda z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją w nadfiolecie (UV)

Title (EN)

Water quality — Determination of microcystins — Method using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet (UV) detection

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme

   Die Proben nach den in ISO 20179 angeführten Normen entnehmen: ISO 5667-4 (natürliche und künstliche Seen) sowie ISO 5667-5 (Trinkwasser aus Aufbereitungsanlagen und aus dem Netz). Zur Herstellung der Reagenzien Wasser der Qualitätsstufe 3 nach ISO 3696 verwenden.

2. Begrenzung der Verluste an Kunststoffen

   Im gesamten Analysengang, wo immer möglich, Teile aus Kunststoff vermeiden (Pipetten, Schläuche, Kartuschen aus Kunststoff) — die Microcystine adsorbieren an ihren Wänden, und das Ergebnis wird um die Verluste erniedrigt.

3. Abtrennen der Biomasse

   Die Wasserprobe, die Cyanobakterienmaterial enthält, durch einen Glasmikrofaserfilter mit einem Rückhaltevermögen von 1–2 µm (Durchmesser bis 47 mm) filtrieren. Dieser Schritt betrifft ausschließlich Proben mit Phytoplankton; das Filtrat wird weiter wie eine Probe reinen Wassers behandelt.

4. Extraktion der Biomasse

   Die Biomasse vom Filter gesondert mit einem Gemisch Methanol/Wasser 75/25 (v/v) extrahieren. Zum Aufschließen der Zellen und zum Dispergieren der Suspension sieht die Norm eine Ultraschallsonde (etwa 60 W, etwa 20 kHz), ein Ultraschallbad, einen Horizontalschüttler sowie eine Zentrifuge mit mindestens 4000 min⁻¹ und einer RZB von mindestens 10 000 g vor. Den Extrakt filtrieren und verdünnen.

5. Anreicherung an der SPE-Kartusche

   Das Filtrat der Probe sowie die Proben reinen Wassers (z. B. Leitungswasser) aus einem 500-ml-Vorratsgefäß mit Unterstützung einer Vakuumpumpe durch eine C-18-SPE-Kartusche leiten. Die Kartusche muss eine Kapazität von mindestens 100 µg jedes Microcystins haben und eine Wiederfindung von mindestens 80 % für MCYST-LR sowie 70 % für MCYST-RR und -YR ergeben.

6. Waschen und Elution

   Die Kartusche mit einem Gemisch Methanol/Wasser 20/80 (v/v) waschen und die Microcystine mit einem Gemisch Methanol/Wasser 90/10 (v/v) unter Zusatz von 0,1 Vol.-% TFA eluieren. Das Eluat nach dem Einengen erneut in einem Gemisch Methanol/Wasser 20/80 (v/v) lösen.

7. Herstellung der Normale

   Die genaue Konzentration jedes Stammnormals spektralphotometrisch ermitteln: in reinem Methanol lösen und die Absorptionskurve 220–250 nm in einer 1-cm-Quarzküvette gegen Methanol aufnehmen, danach die Konzentration aus Gleichung (1) mit ε = 39 800 l/(mol·cm) und einer molaren Masse von 994 (LR), 1044 (YR) oder 1037 g/mol (RR) berechnen. Aus der gemischten Stammlösung von 2,5 µg/ml (aufbewahrt unter −16 °C) fünf Normale herstellen: 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 und 3,0 µg/ml.

8. Chromatographische Trennung

   Die Trennung mit Umkehrphase durchführen. Die Norm gibt einen BEISPIELHAFTEN Gradienten an (Tabelle 1, in der Norm als „an example" bezeichnet; das ist ein Ausgangspunkt für die Optimierung an der eigenen Säule, keine Anforderung): 0 min 30 % A / 70 % B, 10 min 35/65, 40 min 70/30, 42–44 min 100/0, 46–55 min Rückkehr zu 30/70; Fluss 0,3–1,0 ml/min je nach Säule (A — Acetonitril mit TFA, B — Wasser mit TFA; beide Phasen vor der Verwendung entgasen).

   ⏱ Zeit: 55 min je Analyse

9. Detektion und Berechnung des Ergebnisses

   Die Microcystine aus der UV-/DAD-Detektion bei 238 nm mengenmäßig bestimmen, indem die Peakflächen auf die Kalibrierkurve bezogen werden. Das Ergebnis auf den Wert von 1 µg/l Microcystin-LR beziehen (WHO; in Polen ein Parameterwert von 1,0 µg/l).

10. Kontrolle des Verfahrens

    Parallel eine angereicherte Probe untersuchen: eine Kontrolllösung mit einer Konzentration von 1 µg/l jedes der drei Microcystine, hergestellt durch Verdünnen von 200 µl der gemischten Stammlösung auf 500 ml mit Leitungswasser oder mit toxinfreiem Seewasser.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Microcystine sind für den Menschen stark lebertoxisch — die Norm setzt die Warnung schon in die Überschrift; die Arbeit mit den Normlösungen mit Handschuhen und im Abzug durchführen
• Laborabfälle, die Microcystine enthalten, gesondert sammeln und als hochgiftigen chemischen Abfall entsorgen; zulässig ist eine langdauernde Dekontamination mit konzentrierter Natriumhypochloritlösung (NaClO)
• Die Untersuchung dürfen ausschließlich entsprechend geschulte Personen durchführen — die Norm stellt dies als unbedingte Bedingung
• Methanol und Acetonitril sind leicht entzündbar und giftig, Trifluoressigsäure wirkt ätzend — Arbeit im Abzug, mit Handschuhen und Schutzbrille
• Wegen der brennbaren Extraktionslösemittel empfiehlt die Norm nachdrücklich eine explosionsgeschützte Zentrifuge

Häufige Fragen