🍄 Mykotoxine — Aflatoxine, Ochratoxin A
Bestimmung von Mykotoxinen (Aflatoxine B1, B2, G1, G2 und Ochratoxin A) in Lebensmitteln durch Immunaffinitätssäulen (IAC)-Reinigung mit HPLC-FLD-Detektion.
Übersicht
Mykotoxine sind toxische Sekundärmetaboliten von Schimmelpilzen (Aspergillus, Penicillium, Fusarium), die eine ernsthafte Gefahr für die menschliche und tierische Gesundheit darstellen. Aflatoxin B1 ist das stärkste bekannte natürliche Karzinogen (IARC Gruppe 1), und Ochratoxin A ist nephrotoxisch und wahrscheinlich krebserzeugend (Gruppe 2B). EU-Vorschriften (EG-Verordnung 1881/2006, EU-Verordnung 2023/915) legen strenge Grenzwerte in Lebensmitteln fest: Aflatoxin B1 2–12 µg/kg, Summe der Aflatoxine 4–15 µg/kg, Ochratoxin A 3–10 µg/kg.
Die auf den EN 14123 (Aflatoxine) und EN 15851 (Ochratoxin A) Normen basierende Analysemethode beinhaltet die Probenextraktion mit Acetonitril/Wasser (oder Methanol/Wasser) Gemisch, Reinigung auf Immunaffinitätssäulen (IAC) und Bestimmung durch HPLC mit Fluoreszenzdetektion (FLD). IAC-Säulen enthalten monoklonale Antikörper, die Ziel-Mykotoxine spezifisch binden und hohe Reinigungsselektivität gewährleisten.
Aflatoxine B1 und G1 erfordern Post-Column-Fluoreszenz-Derivatisierung (Bromierung mit Jod oder Kobalt, photochemisch UV oder elektrochemisch KOBRA Cell), um das Fluoreszenzsignal zu verstärken. Aflatoxine B2 und G2 fluoreszieren nativ. Ochratoxin A hat starke native Fluoreszenz und erfordert keine Derivatisierung.
Alternativ wird LC-MS/MS-Detektion (ohne Derivatisierung) verwendet, die die gleichzeitige Bestimmung mehrerer Mykotoxine (Aflatoxine, Ochratoxin, Deoxynivalenol, Zearalenon, Fumonisine, T-2/HT-2) in einer Prüfung ermöglicht (Multi-Mykotoxin-Methode). VICAM Myco6in1+ oder R-Biopharm EASI-EXTRACT Säulen ermöglichen die gleichzeitige Reinigung mehrerer Mykotoxine.
Prinzip der Methode
Extraktion: Probe (25–50 g) wird mit Acetonitril/Wasser (80:20 v/v) oder Methanol/Wasser (80:20) Gemisch mit NaCl extrahiert. IAC-Reinigung: Verdünnter Extrakt wird durch Immunaffinitätssäule (z.B. VICAM AflaOchra, R-Biopharm EASI-EXTRACT) geleitet. Mykotoxine binden selektiv an Antikörper auf der Säule, während Matrix-Verunreinigungen mit Wasser ausgewaschen werden. Mykotoxine werden mit Methanol (1–3 mL) eluiert. HPLC-FLD-Detektion: Eluat wird auf C18-Säule injiziert. Aflatoxine werden derivatisiert (KOBRA Cell — elektrochemische Bromierung). Fluoreszenzdetektion: λex 365 nm / λem 435 nm (Aflatoxine), λex 333 nm / λem 460 nm (Ochratoxin A). Quantifizierung aus Kalibrierkurven.
Anwendungen
- Offizielle Kontrolle von Aflatoxinen in Nüssen, Getreide, Gewürzen (EU-Verordnung 2023/915)
- Ochratoxin A Bestimmung in Getreide, Kaffee, Wein, Kakao
- Futtermittel- und Futtermaterialkontrolle (Aflatoxin B1)
- Säuglingsnahrungsprüfung (niedrigste Grenzwerte: 0,10 µg/kg)
- Milchüberwachung — Aflatoxin M1 (Grenzwert 0,050 µg/kg)
- Trockenfrüchtekontrolle (Feigen, Rosinen, Aprikosen)
- BRC/IFS-Zertifizierung importierter Rohstoffe
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Analyte | Aflatoxine B1, B2, G1, G2; Ochratoxin A |
| LOQ Aflatoxin B1 | 0,05–0,50 µg/kg |
| LOQ Ochratoxin A | 0,10–1,0 µg/kg |
| Wiederfindung | 70–110% (je nach Matrix und Analyt) |
| Detektion | HPLC-FLD (Fluoreszenz) oder LC-MS/MS |
| EU-Grenzwerte (Afla B1) | 2–12 µg/kg (je nach Produkt) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN 14123:2008 / PN-EN 15851:2010
- Titel (PL)
- Żywność — Oznaczanie aflatoksyn B1, B2, G1, G2 i ochratoksyny A z zastosowaniem kolumnek immunopowinowactwa i HPLC
- Title (EN)
- Foodstuffs — Determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 and ochratoxin A using immunoaffinity column clean-up and HPLC
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenvorbereitung
Probe mahlen/homogenisieren (mind. 100 g). 25 g in Erlenmeyerkolben einwiegen.
2. Extraktion
5 g NaCl und 100 mL Acetonitril/Wasser (80:20) zugeben. 30 min kräftig schütteln (Orbitalschüttler).
3. Filtration und Verdünnung
Durch Faltenfilter filtrieren. Aliquot (z.B. 10 mL) entnehmen und mit PBS auf 50 mL verdünnen (MeCN-Konzentration < 25% senken).
4. IAC-Reinigung
Verdünnten Extrakt durch IAC-Säule leiten (Durchfluss 1–2 Tropfen/s). Mykotoxine binden an Antikörper.
5. Waschen
Säule mit 20 mL deionisiertem Wasser waschen (Entfernung von Matrix-Verunreinigungen). 30 s absaugen.
6. Elution
Mykotoxine mit 1,5 mL Methanol eluieren (Durchfluss 1 Tropfen/2 s). In HPLC-Vial sammeln. Unter N₂ zur Trockne eindampfen und in Mobile Phase rekonstituieren.
7. HPLC-Injektion
50–100 µL auf C18-Säule injizieren. Mobile Phase: H₂O/MeCN/MeOH mit Essigsäure. Gradient oder isokratisch.
8. FLD-Detektion
Fluoreszenzdetektion mit KOBRA-Zelle: Aflatoxine λex 365 / λem 435 nm, Ochratoxin A λex 333 / λem 460 nm.
9. Quantifizierung
Konzentrationen aus Kalibrierkurven (5–7 Punkte) berechnen. Verdünnungsfaktor und Probenmasse berücksichtigen.
10. Qualitätskontrolle
Jede Serie: Blindprobe, fortifizierte Probe, CRM (FAPAS/BIPEA). Aflatoxin-Wiederfindung 70–110%, Ochratoxin 70–110%. PT-Teilnahme.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| HPLC-System mit FLD-Detektor | Shimadzu Nexera + RF-20Axs, Agilent 1260 Infinity II + FLD, Waters Alliance + FLR | 150 000–350 000 PLN |
| LC-MS/MS-System (Alternative) | Shimadzu LCMS-8060NX, Waters Xevo TQ-XS | 600 000–1 200 000 PLN |
| KOBRA-Derivatisierungszelle | R-Biopharm KOBRA Cell (elektrochemische Bromierung) | 15 000–25 000 PLN |
| Immunaffinitätssäulen (IAC) | VICAM AflaTest / OchraTest / AflaOchra, Packung à 25 Stück | 2 500–5 000 PLN / 25 Stück |
| HPLC C18-Säule | Waters Symmetry C18 (150 × 4,6 mm, 5 µm), Phenomenex Kinetex | 1 500–3 000 PLN |
| Vakuumsystem für IAC | 12/24-Position Vakuum-Manifold, SUPELCO Visiprep | 3 000–8 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Acetonitril HPLC Grade | 75-05-8 | HPLC-Mobile-Phase und Extraktion, 2,5 L |
| Methanol HPLC Grade | 67-56-1 | IAC-Elution und Mobile Phase, 2,5 L |
| Aflatoxin B1, B2, G1, G2 Standards | — | Zertifizierte CRM (Romer Labs, Trilogy), Lösungen in MeCN, 5 mL |
| Ochratoxin A Standard | 303-47-9 | Zertifiziertes CRM, Lösung in MeCN oder Toluol, 1 mL |
| Kaliumbromid KBr (KOBRA Cell) | 7758-02-3 | Salz für elektrochemische Zelle, in-situ Br⁻-Erzeugung |
| Salpetersäure HNO₃ 4 mol/L (KOBRA Cell) | 7697-37-2 | Elektrolyt für KOBRA-Zelle |
| PBS (Phosphatpuffer pH 7,4) | — | Zum Verdünnen des Extrakts vor IAC, Tabletten oder fertig |
| Natriumchlorid NaCl | 7647-14-5 | Extraktionszusatz (Verbesserung der Phasentrennung) |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Aflatoxine — stark krebserzeugend (IARC Gruppe 1). Doppelte Handschuhe verwenden, in abgetrenntem Bereich arbeiten.
- Mykotoxin-Standards — giftig. Im Gefrierschrank (-20°C) lagern. Lösungen unter Abzug vorbereiten.
- Acetonitril — entzündlich und giftig (H225, H302, H312, H332). Unter Abzug arbeiten.
- Methanol — entzündlich und giftig (H225, H301, H311, H331). Giftig beim Einatmen und Verschlucken.
- Aflatoxin-Dekontamination — Natriumhypochloritlösung (5% NaOCl) neutralisiert Aflatoxine auf Oberflächen.
- Mykotoxinhaltige Abfälle — getrennt sammeln und chemisch neutralisieren vor Entsorgung.