🦠 Mesophile Milchsäurebakterien in Lebensmitteln — Plattenzählverfahren auf MRS-Agar (pH 5,7), 30 °C, 72 h

Mikrobiologie PN-ISO 15214

Übersicht

ISO 15214:1998 legt ein horizontales Verfahren zur Zahlbestimmung lebender mesophiler Milchsäurebakterien durch das Zählen der Kolonien fest, die nach einer Bebrütung bei 30 °C über 3 Tage in einem festen Nährmedium wachsen; es wird für Erzeugnisse für Menschen und für Futtermittel angewendet. In manchen Erzeugnissen kommen psychrotrophe oder thermophile Milchsäurebakterien vor, die andere Temperaturen erfordern, und nicht alle Milchsäurebakterien wachsen auf MRS-Agar mit pH 5,7 (manche schlecht). Mesophile Milchsäurebakterien werden als Bakterien definiert, die unter den Bedingungen der Untersuchung bei 30 °C in einem festen selektiven Nährmedium (MRS mit pH 5,7) Kolonien bilden. Gepuffertes Peptonwasser gewährleistet nicht immer eine gute Wiederbelebung der Milchsäurebakterien (Anhang A). In der polnischen wissenschaftlichen Literatur (z. B. Untersuchungen zur Überlebensfähigkeit von Lactobacillus-Stämmen im Modell des Verdauungstrakts, ŻNTJ 2015) wird die Zellzahl der Bakterien „nach PN-ISO 15214:2002 auf dem festen MRS-Nährmedium" bestimmt; in der Lehre (UWM) werden von Joghurts und fermentierten Gemüsesäften je 0,1 ml der Verdünnungen auf MRS-Platten ausgebracht und in Anaerobierbehältern mit Beuteln bebrütet.

Prinzip der Methode

Es werden zwei Platten mit MRS-Agar mit pH 5,7 hergestellt, die im Plattengussverfahren (oder gegebenenfalls im Oberflächenverfahren) mit einer festgelegten Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung beimpft werden, sowie weitere Plattenpaare aus den Zehnerverdünnungen; die Platten werden 72 h bei 30 °C bebrütet; die Bakterienzahl je g oder ml wird aus der Zahl der Kolonien auf den ausgewählten Platten berechnet, gegebenenfalls nach einer Bestätigung. MRS-Nährmedium (de Man, Rogosa, Sharpe) je 1000 ml: Caseinhydrolysat 10 g, Fleischextrakt 10 g, Hefeextrakt 4 g, Triammoniumcitrat 2 g, Natriumacetat 5 g, MgSO₄·7H₂O 0,2 g, MnSO₄·4H₂O 0,05 g, K₂HPO₄ 2 g, Glucose 20 g, Tween 80 1,08 g, Agar 12–18 g; die Bestandteile werden durch Kochen gelöst, der pH-Wert wird so eingestellt, dass er nach der Sterilisation 5,7 ± 0,1 bei 25 °C beträgt (Toleranz ± 0,1, damit der pH-Wert nicht unter 5,6 fällt), 15 min bei 121 °C sterilisiert und auf etwa 47 °C abgekühlt (aufbewahrtes Nährmedium wird im siedenden Bad geschmolzen und auf 47 °C abgekühlt). Bei der Gefahr einer starken Verunreinigung durch Hefen (z. B. getrocknete Würste) wird Sorbinsäure zugegeben: 1,4 g, gelöst in etwa 10 ml 1 mol/l NaOH, filtrationssterilisiert, auf 1000 ml MRS, das auf 47 °C abgekühlt wurde, End-pH-Wert 5,7 ± 0,1. Handelsübliche Fertignährmedien sind zulässig, doch können ihre Zusammensetzung und ihr pH-Wert abweichen und andere Ergebnisse liefern. Das Oberflächenverfahren mit anaerober oder mikroaerophiler Bebrütung (Kerzentöpfe) sowie ein zweischichtiges Nährmedium sind zulässig. Manche Leuconostoc bilden große schleimige Kolonien, die die Entwicklung anderer erschweren (zu niedriges Ergebnis); wegen des möglichen Wachstums anderer Mikroorganismen auf MRS werden die Kolonien bei manchen Erzeugnissen mit einfachen Tests bestätigt (Gram-Färbung, Katalase) — was im Bericht zu vermerken ist. Berechnung: N = ΣC / [V·(n₁ + 0,1·n₂)·d], gerundet auf zwei signifikante Stellen; bei < 15 Kolonien auf den Platten aus der Probe/Erstverdünnung wird eine geschätzte Zahl angegeben (arithmetischer Mittelwert y; NE = y für flüssige Erzeugnisse, y/d für die übrigen).

Anwendungen

• Fermentierte Erzeugnisse: Joghurts, Kefire, Käse, Sauergemüse, fermentierte Gemüsesäfte, gereifte Würste — Kontrolle der Starterkulturen und der Zahl lebender Bakterien
• Probiotika und Nahrungsergänzungsmittel (Zahl lebender Lactobacillus-Zellen), Untersuchungen der Überlebensfähigkeit im Modell des Verdauungstrakts
• Beurteilung des Verderbs von Erzeugnissen durch Milchsäurebakterien (vakuumverpacktes Fleisch, Salate, Getränke)
• Futtermittel und Silagen (Impfmittel), pflanzliche Rohstoffe
• Qualitätskontrolle des MRS-Nährmediums und der Kulturen in der Milchwirtschaft

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-ISO 15214:2002 (ISO 15214:1998)

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby mezofilnych bakterii fermentacji mlekowej — Metoda płytkowa w temperaturze 30 stopni C

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria — Colony-count technique at 30 °C

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Nährmedium

   Löse die MRS-Bestandteile durch Kochen, stelle den pH-Wert so ein, dass er nach der Sterilisation 5,7 ± 0,1 bei 25 °C beträgt, sterilisiere 15 min bei 121 °C und kühle auf etwa 47 °C ab (aufbewahrtes Nährmedium schmilz im siedenden Bad und kühle auf 47 °C ab); gib bei Hefegefahr die filtrierte Sorbinsäurelösung zu (1,4 g in etwa 10 ml 1 mol/l NaOH je 1 l).

2. Probe und Verdünnungen

   Stelle die Erstverdünnung und die Zehnerverdünnungen nach ISO 6887-1 her; die Probe muss repräsentativ und beim Transport unbeschädigt sein.

3. Beimpfung

   Überführe in zwei sterile Platten je 1 ml der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung, in die weiteren Paare je 1 ml der weiteren Verdünnungen (für jede Verdünnung eine neue Pipette); beimpfe bei hohen Zahlen nur die für das Zählen erforderlichen Verdünnungen.

4. Übergießen

   Gieße in jede Platte etwa 15 ml MRS mit einer Temperatur von etwa 47 °C, mische vorsichtig und lasse erstarren (alternativ Oberflächenverfahren mit anaerober oder mikroaerophiler Bebrütung oder zweischichtiger MRS).

5. Bebrütung

   Bebrüte die umgedrehten Platten 72 h ± 3 h bei 30 °C und schütze den Agar vor dem Austrocknen.

6. Zählen und Bestätigung

   Zähle die Kolonien auf den Platten mit < 300 Kolonien in zwei aufeinanderfolgenden Verdünnungen und ≥ 15 auf mindestens einer; berücksichtige mögliche schleimige Leuconostoc-Kolonien; bestätige die Kolonien bei Bedarf mit der Gram-Färbung und dem Katalase-Test (vermerke dies im Bericht).

7. Berechnung

   N = ΣC/[V(n₁ + 0,1n₂)d] (z. B. (168 + 215 + 14 + 25)/[1·(2 + 0,2)·10⁻²] = 19 182 → 1,9 × 10⁴/g); bei < 15 Kolonien — geschätzte Zahl NE = y (flüssige) oder y/d (übrige); Ergebnis als 1,0–9,9 × 10ⁿ je g oder ml.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Milchsäurebakterien sind nicht krankheitserregend, Lebensmittelproben können jedoch Krankheitserreger enthalten — gute mikrobiologische Praxis
• Heißer Agar (47 °C) und siedendes Bad — Schutz vor Verbrennungen; 1 mol/l NaOH — ätzend
• Anaerobiertöpfe mit Kerze oder mit Generatoren — Vorsicht mit offenem Feuer und Wasserstoff

Häufige Fragen