🦠 Listeria monocytogenes und Listeria spp. in Lebensmitteln — Zahlbestimmung auf ALOA-Agar (Ottaviani-Agosti)

Mikrobiologie PN-EN ISO 11290-2

Übersicht

ISO 11290-2:2017 legt ein horizontales Verfahren zur Zahlbestimmung von L. monocytogenes sowie von Listeria spp. (einschließlich L. monocytogenes) in Erzeugnissen für Menschen und Tiere sowie in Umgebungsproben aus der Herstellung von und dem Verkehr mit Lebensmitteln fest; manche neu beschriebenen Listeria-Arten werden mit diesem Verfahren möglicherweise nicht bestimmt oder nicht bestätigt. Die zweite Ausgabe ersetzte ISO 11290-2:1998 mit der Änderung A1:2004; die wichtigsten Änderungen: die Erstverdünnung in gepuffertem Peptonwasser oder in Half-Fraser-Bouillon (mit oder ohne Supplemente) und in den Verdünnungsmitteln der ISO 6887, die Streichung der Stufe der Wiederbelebung, die mikroskopische Prüfung sowie die Katalase- und die CAMP-Prüfung als wahlweise, neue Leistungsmerkmale sowie die Aufnahme der Zahlbestimmung von Listeria spp. in den Anwendungsbereich. Die Änderungen wurden als wesentlich eingestuft (ISO 17468), jedoch ohne bedeutenden Einfluss auf die Leistungsmerkmale des Verfahrens. Die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 der Kommission nennt EN/ISO 11290-2 als Referenzverfahren für das Sicherheitskriterium von 100 KBE/g für verzehrfertige Lebensmittel (in denen das Wachstum von L. monocytogenes möglich oder nicht möglich ist; Plan mit 5 Proben, c = 0). Listerien sind grampositive, kurze Stäbchen ohne Sporen und ohne Kapsel, fakultativ anaerob und psychrotroph, bei 20–25 °C beweglich, katalasepositiv und oxidasenegativ; L. monocytogenes wächst von −2 °C bis 45 °C und bei pH 4,4–9, und die Listeriose hat eine Sterblichkeit von 20–30 % — die Untersuchungen sind in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 durchzuführen, und schwangere Personen sowie Personen mit geschwächter zellulärer Immunität sollten nicht mit den Kulturen arbeiten.

Prinzip der Methode

Die Zahlbestimmung erfordert fünf aufeinanderfolgende Stufen (Schema im Anhang A): die Herstellung der Erstverdünnung in einem für die Probe geeigneten Verdünnungsmittel; das Ausbringen einer festgelegten Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung und erforderlichenfalls der Zehnerverdünnungen im Oberflächenverfahren auf den Listeria-Agar nach Ottaviani und Agosti; die Bebrütung bei 37 °C mit der Beurteilung nach 24 h und nach weiteren 24 h; die Bestätigung der präsumtiven Kolonien mit morphologischen und biochemischen Prüfungen; die Berechnung der Zahl je g, ml, cm² oder je Probenahmegerät. Als Verdünnungsmittel der Erstverdünnung dient gepuffertes Peptonwasser oder ein anderes nach ISO 6887; wird an derselben Probe auch der Nachweis nach ISO 11290-1 ausgeführt, so kann Half-Fraser-Bouillon verwendet werden (die selektiven Faktoren werden am besten nach dem Ausbringen für die Zahlbestimmung zugesetzt; bei supplementierter Half-Fraser-Bouillon sind die Platten binnen 45 min zu beimpfen). Ausgebracht werden 0,1 ml auf eine kleine Platte (90 mm); bei geringen Zahlen wird die Nachweisgrenze um das Zehnfache gesenkt, indem 1 ml untersucht und auf einer großen Platte (140 mm) oder auf drei kleinen verteilt wird (mit Doppelbestimmung, wenn nur die Erstverdünnung verwendet wird); das Inokulum wird rasch mit einem Drigalski-Spatel verteilt, ohne die Ränder zu berühren, und etwa 15 min zum Einziehen stehen gelassen. Die Platten werden umgedreht bei 37 °C 24 h ± 2 h und weitere 24 h ± 2 h bebrütet. L. monocytogenes bildet blaugrüne Kolonien, die von einer trüben (opaleszierenden) Zone umgeben sind (ebenso L. ivanovii; Stämme nach einem Säurestress können einen schwachen oder gar keinen Hof aufweisen; seltene Stämme mit langsamer PIPLC-Aktivität zeigen sich erst nach > 4 Tagen); Listeria spp. — blaugrün mit oder ohne Hof (andere Organismen können blaue Kolonien ergeben — Anhang C). Gezählt werden Platten mit < 150 charakteristischen Kolonien (< 360 bei 140 mm), bei Mischkulturen oder großen, sich überlagernden Höfen — < 100 (< 240). Für die Bestätigung werden von jeder Platte 5 für die Typen repräsentative Kolonien entnommen, auf ein nichtselektives Nährmedium (Blutagar, Nähragar, TSYEA) überimpft und bei 37 °C 18–24 h bebrütet. Für L. monocytogenes obligatorische Prüfungen: β-Hämolyse +, L-Rhamnose +, D-Xylose −; wahlweise: mikroskopisches Bild (dünne kurze Stäbchen/Kokkobazillen), Katalase +, Beweglichkeit bei 25 °C +, CAMP-Test +; seltene nichthämolytische Stämme erfordern zusätzliche Prüfungen (Gram, Katalase, Beweglichkeit, CAMP, PCR). Zulässig sind miniaturisierte biochemische Testgalerien und alternative Vorgehensweisen nach ISO 7218 nach der Überprüfung ihrer Eignung.

Anwendungen

• Sicherheitskriterium 100 KBE/g L. monocytogenes in verzehrfertigen Lebensmitteln — Referenzverfahren der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 (Kat. 1.2 und 1.3)
• Käse und Milcherzeugnisse, verzehrfertige Wurst- und Fleischerzeugnisse, geräucherte Fische, Salate, gekühlte Erzeugnisse mit langer Haltbarkeit
• Umgebungsproben (Oberflächen, Geräte) in Betrieben, die verzehrfertige Lebensmittel herstellen — Monitoring von Listeria spp. als Indikator
• Futtermittel und Rohstoffe; Haltbarkeitsuntersuchungen (Challenge-Tests), die die Zahl der Listerien erfordern
• Verbundene Untersuchung von Nachweis (ISO 11290-1) und Zahlbestimmung aus einer Erstverdünnung in Half-Fraser-Bouillon

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 11290-2:2017-07 (ISO 11290-2:2017)

Titel (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i innych Listeria spp. — Część 2: Metoda oznaczania liczby

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 2: Enumeration method

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probe und Erstverdünnung

   Bereite die Probe nach ISO 6887 (oder nach ISO 18593 für Oberflächen) vor; stelle die Erstverdünnung in gepuffertem Peptonwasser oder in einem anderen Verdünnungsmittel nach ISO 6887 oder in Half-Fraser-Bouillon her, wenn du gleichzeitig den Nachweis nach ISO 11290-1 ausführst (das Supplement nach dem Ausbringen zusetzen; mit Supplement binnen 45 min ausbringen).

2. Ausbringen im Oberflächenverfahren

   Bringe 0,1 ml der Erstverdünnung (oder der flüssigen Probe) und 0,1 ml der weiteren Verdünnungen auf ALOA-Platten von 90 mm auf; bei geringen Zahlen — 1 ml auf eine Platte von 140 mm oder auf drei Platten von 90 mm (getrocknet), mit Doppelbestimmung, wenn du nur die Erstverdünnung verwendest. Verteile rasch mit dem Drigalski-Spatel (ein neuer für jede Verdünnung oder derselbe, beginnend bei der höchsten Verdünnung) und lass etwa 15 min zum Einziehen stehen.

3. Bebrütung

   Bebrüte die umgedrehten Platten bei 37 °C 24 h ± 2 h, beurteile sie und bebrüte weitere 24 h ± 2 h.

4. Zählung

   Zähle nach 24 h (bevor sich die Höfe überlagern) und nach 48 h die blaugrünen Kolonien mit trübem Hof (präsumtive L. monocytogenes) sowie die blaugrünen mit oder ohne Hof (präsumtive Listeria spp.) auf Platten mit < 150 (90 mm) oder < 360 (140 mm) charakteristischen Kolonien; bei Mischkulturen oder großen Höfen — < 100 / < 240. Behandle drei Platten von 90 mm mit 1 ml als eine einzige.

5. Bestätigung

   Entnimm jeder Platte (Verdünnung) 5 für die Typen repräsentative Kolonien (bei < 5 — alle), überimpfe sie auf ein nichtselektives Nährmedium (L. monocytogenes: Blutagar, Nähragar oder TSYEA; Listeria spp.: TSYEA) und bebrüte bei 37 °C 18–24 h. Führe die obligatorischen Prüfungen aus: β-Hämolyse, L-Rhamnose, D-Xylose (mit Kontrollen), wahlweise die Katalase, die Beweglichkeit bei 25 °C, CAMP und das mikroskopische Bild; bei typischen Kolonien ohne Hämolyse — zusätzliche Prüfungen (Gram, Katalase, Beweglichkeit, CAMP, PCR).

6. Berechnung und Prüfbericht

   Berechne aus der Zahl der bestätigten Kolonien die Zahl von L. monocytogenes und/oder Listeria spp. je g, ml, cm² oder je Probenahmegerät; vergleiche mit dem Kriterium von 100 KBE/g (Verordnung 2073/2005) und beschreibe die Abweichungen.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• L. monocytogenes — Arbeit ausschließlich in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2, unter der Aufsicht eines Mikrobiologen, mit sorgfältiger Entsorgung der bebrüteten Materialien
• Schwangere Personen sowie Personen mit Erkrankungen, die die zelluläre Immunität beeinträchtigen, sollten nicht mit Listeria-Kulturen arbeiten (Risiko für den Fötus)
• CAMP-Tests mit S. aureus und R. equi sowie Blutagar — Umgang wie mit infektiösem Material

Häufige Fragen