🔴 Nachweis von Listeria monocytogenes
Kurz gefasst
Zweistufige selektive Anreicherung und Ausstrich auf chromogenen Nährböden zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln. Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 11290-1:2017; Ergebnis: Nachgewiesen / Nicht nachgewiesen in 25 g. Das Verfahren umfasst 12 Schritte (insgesamt rund 3 Tage 5 Min.–4 Tage 2 Std. 5 Min.); eingesetzt wird sie unter anderem für: Verzehrfertige Lebensmittel — Weichkäse, Aufschnitt, Räucherfisch, Säuglingsnahrung und Lebensmittel für besondere medizinische Zwecke, Fleisch und Fleischerzeugnisse (Geflügel, Schwein).
Auf einen Blick
- Norm: PN-EN ISO 11290-1:2017
- Kategorie: Mikrobiologie
- Verfahrensschritte: 12
- Gesamtdauer der Schritte: 3 Tage 5 Min.–4 Tage 2 Std. 5 Min.
- Ergebnis: Nachgewiesen / Nicht nachgewiesen in 25 g
- Probenmenge: 25 g (Standard)
- Zeitdauer bis zum Ergebnis: 5–7 Arbeitstage
Übersicht
Listeria monocytogenes ist ein grampositives Stäbchenbakterium und einer der gefährlichsten lebensmittelbedingten Krankheitserreger. Es verursacht Listeriose — eine Erkrankung mit einer Letalität von 20–30% (die höchste unter den lebensmittelbedingten Erkrankungen). Besonders gefährdet sind Schwangere (Fehlgeburten, Neugeboreneninfektionen), ältere Menschen und immungeschwächte Personen.
L. monocytogenes ist besonders gefährlich, weil es: sich bei Kühlschranktemperaturen (2–4°C) vermehrt, hohe Salzkonzentrationen (bis 10% NaCl) toleriert und in einem breiten pH-Bereich (4,4–9,6) überlebt. Es bildet Biofilme auf Oberflächen von Lebensmittelproduktionsbetrieben, was seine Eliminierung erschwert.
Die Norm PN-EN ISO 11290-1 ist die Referenzmethode zum Nachweis von L. monocytogenes in allen Arten von Lebensmitteln und Futtermitteln. Gefordert durch Verordnung (EG) 2073/2005 — Sicherheitskriterium: in 25 g nicht nachweisbar für verzehrfertige Lebensmittel für Säuglinge und für medizinische Zwecke, sowie ≤100 KBE/g in verzehrfertigen Lebensmitteln während der Haltbarkeitsdauer.
Prinzip der Methode
Methode der zweistufigen selektiven Anreicherung:
1. **Primäre Anreicherung (Half Fraser)** — 25 g Probe + 225 mL Half-Fraser-Bouillon (halbe Konzentration von Acriflavin und Nalidixinsäure). Inkubation 30°C / 24–26 h. Milde Selektion, die die Regeneration geschädigter Zellen ermöglicht. 2. **Sekundäre Anreicherung (Fraser komplett)** — 0,1 mL → 10 mL Fraser-Bouillon (volle Inhibitorkonzentration). Inkubation 37°C / 24–48 h. Dunkelfärbung der Bouillon (Äsculinhydrolyse → schwarzer Niederschlag) deutet auf Listeria hin. 3. **Ausstrich auf Selektivnährböden** — ALOA (chromogen) und Oxford/PALCAM. L. monocytogenes-Kolonien auf ALOA: blaugrün mit opakem Hof (Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C, PI-PLC). 4. **Bestätigung** — Hämolyse auf Blutagar, CAMP-Test, Beweglichkeit bei 25°C (Regenschirmmuster), Zuckerfermentation (Rhamnose+, Xylose–).
Anwendungen
- Verzehrfertige Lebensmittel — Weichkäse, Aufschnitt, Räucherfisch
- Säuglingsnahrung und Lebensmittel für besondere medizinische Zwecke
- Fleisch und Fleischerzeugnisse (Geflügel, Schwein)
- Fischerzeugnisse — roh und geräuchert (Lachs, Makrele)
- Milchprodukte — Käse, Speiseeis, pasteurisierte Milch
- Verzehrfertiges Gemüse und Obst (Salate, Smoothies)
- Umgebungsmonitoring von Betrieben (Abstriche von Oberflächen, Abflüssen und Kühlräumen)
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Ergebnis | Nachgewiesen / Nicht nachgewiesen in 25 g |
| Probenmenge | 25 g (Standard) |
| Zeitdauer bis zum Ergebnis | 5–7 Arbeitstage |
| Anreicherung I Temperatur | 30 ± 1°C (Half Fraser) |
| Anreicherung II Temperatur | 37 ± 1°C (Fraser) |
| Nachweisgrenze | 1 Zelle / 25 g |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 11290-1:2017
- Titel (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i Listeria spp. — Część 1: Metoda wykrywania
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method
Schritt-für-Schritt-Verfahren
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Probenvorbereitung
25 g Probe in einen Stomacher-Beutel einwiegen. 225 mL Half-Fraser-Bouillon zugeben. 1–2 Min. homogenisieren.
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Anreicherung I — Half Fraser
Beutel mit Probe bei 30±1°C für 24–26 Stunden inkubieren. Nach Inkubation Bouillon beobachten — Dunkelfärbung deutet auf Äsculinhydrolyse hin (Anwesenheit von Listeria spp.).
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Anreicherung II — Fraser komplett
0,1 mL der Half-Fraser-Anreicherung in 10 mL Fraser-Bouillon (komplett) überführen. Bei 37±1°C / 24 Stunden (erste Ablesung) und bis 48 Stunden (zweite Ablesung) inkubieren.
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Ausstrich von Half Fraser (24 h)
Aus der Half-Fraser-Anreicherung mit der Impföse auf ALOA-Agar und einen zweiten Nährboden (Oxford oder PALCAM) ausstreichen. Bei 37°C / 24–48 h inkubieren.
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Ausstrich von Fraser (24 h und 48 h)
Nach 24 h und 48 h der Fraser-Bouillon mit der Impföse auf ALOA-Agar und einen zweiten Nährboden ausstreichen. Bei 37°C / 24–48 h inkubieren.
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Plattenablesung
Auf ALOA: L. monocytogenes-Kolonien = blaugrün mit opakem Hof (PI-PLC+). Auf Oxford: schwarze Kolonien mit schwarzem Hof (Äsculin+).
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Reinkulturisolierung
Mind. 5 verdächtige Kolonien auswählen. Auf TSYEA-Agar überimpfen. Bei 37°C / 18–24 h inkubieren. Kolonien beobachten: L. monocytogenes — klein, gräulich, glänzend unter Henry-Beleuchtung (blaugrauer Schimmer).
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Hämolysetest
Aus Reinkultur auf 5% Schafblutagar ausstreichen. Bei 37°C/24 h inkubieren. L. monocytogenes: schmale Zone der β-Hämolyse (klarer Hof um die Kolonien).
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CAMP-Test
S. aureus und R. equi senkrecht auf Blutagar aufstreichen. Prüfisolat senkrecht dazu aufstreichen. Bei 37°C/18–24 h inkubieren. L. monocytogenes: verstärkte Hämolyse in der Nähe von S. aureus, keine Verstärkung bei R. equi.
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Beweglichkeitstest
Halbfestes Medium (0,4% Beweglichkeitsagar) beimpfen. Bei 25°C/48 h inkubieren. L. monocytogenes: „Regenschirm“-Wachstumsmuster 2–5 mm unter der Oberfläche (bei 25°C beweglich, bei 37°C unbeweglich).
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Zuckerfermentation
Rhamnose: POSITIV (L. monocytogenes). Xylose: NEGATIV. Mannit: NEGATIV. Diese 3 Tests unterscheiden L. monocytogenes von anderen Listeria-Spezies.
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Interpretation und Berichterstattung
Bestätigung = β-Hämolyse + CAMP+ bei S. aureus + Regenschirm-Beweglichkeit + Rhamnose+ Xylose– → „Listeria monocytogenes NACHGEWIESEN in 25 g“. Fehlen = „NICHT NACHGEWIESEN“.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Brutschrank 30±1°C | Memmert IN110, Binder BD 115 | 5 000–15 000 PLN |
| Brutschrank 37±1°C | Memmert IN110, POL-EKO ST 2 | 5 000–15 000 PLN |
| Stomacher (Homogenisator) | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| Autoklav | Tuttnauer 3870ELV, Systec VX-75 | 30 000–80 000 PLN |
| Sicherheitswerkbank Klasse II | ESCO Airstream, Thermo MSC-Advantage | 25 000–60 000 PLN |
| Mikroskop mit Henry-Beleuchtung | Olympus CX43, zur Beobachtung der Koloniemorphologie | 8 000–20 000 PLN |
| Automatische Pipetten | Eppendorf Research Plus 0,1 mL + 1 mL | 800–1 500 PLN/St. |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Half-Fraser-Bouillon | — | Fraser-Basis + halbe Konzentration von Acriflavin (12,5 mg/L) und Nalidixinsäure (10 mg/L). Merck 1.10398, Oxoid CM0895. |
| Fraser-Bouillon (komplett) | — | Volle Inhibitorkonzentration: Acriflavin 25 mg/L, Nalidixinsäure 20 mg/L, Lithiumchlorid 3 g/L, Äsculin + Ammoniumeisen(III)-citrat. Merck 1.10399. |
| ALOA-Agar (chromogen) | — | Chromogener Nährboden: L. monocytogenes = blaugrüne Kolonien mit opakem Hof (PI-PLC+). Andere Listeria = blaugrün OHNE Hof. Merck 1.00427, bioMérieux. |
| Oxford-Agar | — | Mit Supplement (Cycloheximid, Colistin, Acriflavin, Cefotetan, Phosphate). Kolonien: schwarz mit schwarzem Hof (Äsculin). Oxoid CM0856. |
| TSYEA-Agar | — | Tryptic Soy Yeast Extract Agar — zur Reinkulturisolierung. TSA + 0,6% Hefeextrakt. |
| 5% Schafblutagar | — | Für den Hämolysetest — L. monocytogenes bildet eine schmale Zone der β-Hämolyse. |
| Staphylococcus aureus-Stamm ATCC 25923 | — | Für den CAMP-Test — verstärkte Hämolyse in der S. aureus-Zone. |
| Rhodococcus equi-Stamm ATCC 6939 | — | Für den CAMP-Test — keine Verstärkung (Unterscheidung von L. ivanovii). |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Listeria monocytogenes — BSL-2-Erreger! Arbeit ausschließlich in der Sicherheitswerkbank
- Besonders gefährlich für Schwangere — schwangeres Personal muss von der Arbeit mit L. monocytogenes ausgeschlossen werden
- Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille obligatorisch
- Alle Abfälle müssen vor der Entsorgung autoklaviert werden (121°C/20 Min.)
- Desinfektion des Arbeitsplatzes nach Gebrauch: 70% Ethanol + 0,5% Natriumhypochlorit-Lösung
- Schafblut — potenzielle Allergenquelle, vorsichtig handhaben
Häufige Fragen
Welche Norm beschreibt diese Prüfung?
Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 11290-1:2017 — „Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method“.
Wie funktioniert diese Methode?
Methode der zweistufigen selektiven Anreicherung: 1. **Primäre Anreicherung (Half Fraser)** — 25 g Probe + 225 mL Half-Fraser-Bouillon (halbe Konzentration von Acriflavin und Nalidixinsäure).
Wie groß sind Messbereich und Genauigkeit?
Ergebnis: Nachgewiesen / Nicht nachgewiesen in 25 g; Probenmenge: 25 g (Standard); Zeitdauer bis zum Ergebnis: 5–7 Arbeitstage; Anreicherung I Temperatur: 30 ± 1°C (Half Fraser).
Wie lange dauert die Prüfung?
Die für die einzelnen Schritte angegebenen Zeiten ergeben zusammen rund 3 Tage 5 Min.–4 Tage 2 Std. 5 Min. Das Verfahren umfasst 12 Schritte.
Welche Geräte werden benötigt?
Brutschrank 30±1°C, Brutschrank 37±1°C, Stomacher (Homogenisator), Autoklav, Sicherheitswerkbank Klasse II, Mikroskop mit Henry-Beleuchtung, Automatische Pipetten. Richtpreis für das Kerngerät (Brutschrank 30±1°C): 5 000–15 000 PLN.
Wo wird diese Prüfung eingesetzt?
Verzehrfertige Lebensmittel — Weichkäse, Aufschnitt, Räucherfisch; Säuglingsnahrung und Lebensmittel für besondere medizinische Zwecke; Fleisch und Fleischerzeugnisse (Geflügel, Schwein); Fischerzeugnisse — roh und geräuchert (Lachs, Makrele); Milchprodukte — Käse, Speiseeis, pasteurisierte Milch; Verzehrfertiges Gemüse und Obst (Salate, Smoothies); Umgebungsmonitoring von Betrieben (Abstriche von Oberflächen, Abflüssen und Kühlräumen).
Welche Sicherheitsmaßnahmen gelten?
Listeria monocytogenes — BSL-2-Erreger! Arbeit ausschließlich in der Sicherheitswerkbank; Besonders gefährlich für Schwangere — schwangeres Personal muss von der Arbeit mit L. monocytogenes ausgeschlossen werden; Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille obligatorisch; Alle Abfälle müssen vor der Entsorgung autoklaviert werden (121°C/20 Min.); Desinfektion des Arbeitsplatzes nach Gebrauch: 70% Ethanol + 0,5% Natriumhypochlorit-Lösung; Schafblut — potenzielle Allergenquelle, vorsichtig handhaben.
Welches Labor führt diese Prüfung durch?
Die Prüfung führen nach ISO/IEC 17025 akkreditierte Labore durch. Auf LabCoda finden Sie sie über die Normnummer PN-EN ISO 11290-1.