🔴 Nachweis von Listeria monocytogenes
Zweistufige selektive Anreicherung und Ausstrich auf chromogenen Nährböden zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln. Eine kritische Lebensmittelsicherheitsprüfung.
Übersicht
Listeria monocytogenes ist ein grampositives Stäbchenbakterium und einer der gefährlichsten lebensmittelbedingten Krankheitserreger. Es verursacht Listeriose — eine Erkrankung mit einer Letalität von 20–30% (die höchste unter den lebensmittelbedingten Erkrankungen). Besonders gefährdet sind Schwangere (Fehlgeburten, Neugeboreneninfektionen), ältere Menschen und immungeschwächte Personen.
L. monocytogenes ist besonders gefährlich, weil es: sich bei Kühlschranktemperaturen (2–4°C) vermehrt, hohe Salzkonzentrationen (bis 10% NaCl) toleriert und in einem breiten pH-Bereich (4,4–9,6) überlebt. Es bildet Biofilme auf Oberflächen von Lebensmittelproduktionsbetrieben, was seine Eliminierung erschwert.
Die Norm PN-EN ISO 11290-1 ist die Referenzmethode zum Nachweis von L. monocytogenes in allen Arten von Lebensmitteln und Futtermitteln. Gefordert durch Verordnung (EG) 2073/2005 — Sicherheitskriterium: in 25 g nicht nachweisbar für verzehrfertige Lebensmittel für Säuglinge und für medizinische Zwecke, sowie ≤100 KBE/g in verzehrfertigen Lebensmitteln während der Haltbarkeitsdauer.
Prinzip der Methode
Methode der zweistufigen selektiven Anreicherung:
1. **Primäre Anreicherung (Half Fraser)** — 25 g Probe + 225 mL Half-Fraser-Bouillon (halbe Konzentration von Acriflavin und Nalidixinsäure). Inkubation 30°C / 24–26 h. Milde Selektion, die die Regeneration geschädigter Zellen ermöglicht. 2. **Sekundäre Anreicherung (Fraser komplett)** — 0,1 mL → 10 mL Fraser-Bouillon (volle Inhibitorkonzentration). Inkubation 37°C / 24–48 h. Dunkelfärbung der Bouillon (Äsculinhydrolyse → schwarzer Niederschlag) deutet auf Listeria hin. 3. **Ausstrich auf Selektivnährböden** — ALOA (chromogen) und Oxford/PALCAM. L. monocytogenes-Kolonien auf ALOA: blaugrün mit opakem Hof (Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C, PI-PLC). 4. **Bestätigung** — Hämolyse auf Blutagar, CAMP-Test, Beweglichkeit bei 25°C (Regenschirmmuster), Zuckerfermentation (Rhamnose+, Xylose–).
Anwendungen
- Verzehrfertige Lebensmittel — Weichkäse, Aufschnitt, Räucherfisch
- Säuglingsnahrung und Lebensmittel für besondere medizinische Zwecke
- Fleisch und Fleischerzeugnisse (Geflügel, Schwein)
- Fischerzeugnisse — roh und geräuchert (Lachs, Makrele)
- Milchprodukte — Käse, Speiseeis, pasteurisierte Milch
- Verzehrfertiges Gemüse und Obst (Salate, Smoothies)
- Umgebungsmonitoring von Betrieben (Abstriche von Oberflächen, Abflüssen und Kühlräumen)
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Ergebnis | Nachgewiesen / Nicht nachgewiesen in 25 g |
| Probenmenge | 25 g (Standard) |
| Zeitdauer bis zum Ergebnis | 5–7 Arbeitstage |
| Anreicherung I Temperatur | 30 ± 1°C (Half Fraser) |
| Anreicherung II Temperatur | 37 ± 1°C (Fraser) |
| Nachweisgrenze | 1 Zelle / 25 g |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 11290-1:2017
- Titel (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i Listeria spp. — Część 1: Metoda wykrywania
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenvorbereitung
25 g Probe in einen Stomacher-Beutel einwiegen. 225 mL Half-Fraser-Bouillon zugeben. 1–2 Min. homogenisieren.
2. Anreicherung I — Half Fraser
Beutel mit Probe bei 30±1°C für 24–26 Stunden inkubieren. Nach Inkubation Bouillon beobachten — Dunkelfärbung deutet auf Äsculinhydrolyse hin (Anwesenheit von Listeria spp.).
3. Anreicherung II — Fraser komplett
0,1 mL der Half-Fraser-Anreicherung in 10 mL Fraser-Bouillon (komplett) überführen. Bei 37±1°C / 24 Stunden (erste Ablesung) und bis 48 Stunden (zweite Ablesung) inkubieren.
4. Ausstrich von Half Fraser (24 h)
Aus der Half-Fraser-Anreicherung mit der Impföse auf ALOA-Agar und einen zweiten Nährboden (Oxford oder PALCAM) ausstreichen. Bei 37°C / 24–48 h inkubieren.
5. Ausstrich von Fraser (24 h und 48 h)
Nach 24 h und 48 h der Fraser-Bouillon mit der Impföse auf ALOA-Agar und einen zweiten Nährboden ausstreichen. Bei 37°C / 24–48 h inkubieren.
6. Plattenablesung
Auf ALOA: L. monocytogenes-Kolonien = blaugrün mit opakem Hof (PI-PLC+). Auf Oxford: schwarze Kolonien mit schwarzem Hof (Äsculin+).
7. Reinkulturisolierung
Mind. 5 verdächtige Kolonien auswählen. Auf TSYEA-Agar überimpfen. Bei 37°C / 18–24 h inkubieren. Kolonien beobachten: L. monocytogenes — klein, gräulich, glänzend unter Henry-Beleuchtung (blaugrauer Schimmer).
8. Hämolysetest
Aus Reinkultur auf 5% Schafblutagar ausstreichen. Bei 37°C/24 h inkubieren. L. monocytogenes: schmale Zone der β-Hämolyse (klarer Hof um die Kolonien).
9. CAMP-Test
S. aureus und R. equi senkrecht auf Blutagar aufstreichen. Prüfisolat senkrecht dazu aufstreichen. Bei 37°C/18–24 h inkubieren. L. monocytogenes: verstärkte Hämolyse in der Nähe von S. aureus, keine Verstärkung bei R. equi.
10. Beweglichkeitstest
Halbfestes Medium (0,4% Beweglichkeitsagar) beimpfen. Bei 25°C/48 h inkubieren. L. monocytogenes: „Regenschirm“-Wachstumsmuster 2–5 mm unter der Oberfläche (bei 25°C beweglich, bei 37°C unbeweglich).
11. Zuckerfermentation
Rhamnose: POSITIV (L. monocytogenes). Xylose: NEGATIV. Mannit: NEGATIV. Diese 3 Tests unterscheiden L. monocytogenes von anderen Listeria-Spezies.
12. Interpretation und Berichterstattung
Bestätigung = β-Hämolyse + CAMP+ bei S. aureus + Regenschirm-Beweglichkeit + Rhamnose+ Xylose– → „Listeria monocytogenes NACHGEWIESEN in 25 g“. Fehlen = „NICHT NACHGEWIESEN“.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Brutschrank 30±1°C | Memmert IN110, Binder BD 115 | 5 000–15 000 PLN |
| Brutschrank 37±1°C | Memmert IN110, POL-EKO ST 2 | 5 000–15 000 PLN |
| Stomacher (Homogenisator) | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| Autoklav | Tuttnauer 3870ELV, Systec VX-75 | 30 000–80 000 PLN |
| Sicherheitswerkbank Klasse II | ESCO Airstream, Thermo MSC-Advantage | 25 000–60 000 PLN |
| Mikroskop mit Henry-Beleuchtung | Olympus CX43, zur Beobachtung der Koloniemorphologie | 8 000–20 000 PLN |
| Automatische Pipetten | Eppendorf Research Plus 0,1 mL + 1 mL | 800–1 500 PLN/St. |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Half-Fraser-Bouillon | — | Fraser-Basis + halbe Konzentration von Acriflavin (12,5 mg/L) und Nalidixinsäure (10 mg/L). Merck 1.10398, Oxoid CM0895. |
| Fraser-Bouillon (komplett) | — | Volle Inhibitorkonzentration: Acriflavin 25 mg/L, Nalidixinsäure 20 mg/L, Lithiumchlorid 3 g/L, Äsculin + Ammoniumeisen(III)-citrat. Merck 1.10399. |
| ALOA-Agar (chromogen) | — | Chromogener Nährboden: L. monocytogenes = blaugrüne Kolonien mit opakem Hof (PI-PLC+). Andere Listeria = blaugrün OHNE Hof. Merck 1.00427, bioMérieux. |
| Oxford-Agar | — | Mit Supplement (Cycloheximid, Colistin, Acriflavin, Cefotetan, Phosphate). Kolonien: schwarz mit schwarzem Hof (Äsculin). Oxoid CM0856. |
| TSYEA-Agar | — | Tryptic Soy Yeast Extract Agar — zur Reinkulturisolierung. TSA + 0,6% Hefeextrakt. |
| 5% Schafblutagar | — | Für den Hämolysetest — L. monocytogenes bildet eine schmale Zone der β-Hämolyse. |
| Staphylococcus aureus-Stamm ATCC 25923 | — | Für den CAMP-Test — verstärkte Hämolyse in der S. aureus-Zone. |
| Rhodococcus equi-Stamm ATCC 6939 | — | Für den CAMP-Test — keine Verstärkung (Unterscheidung von L. ivanovii). |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Listeria monocytogenes — BSL-2-Erreger! Arbeit ausschließlich in der Sicherheitswerkbank
- Besonders gefährlich für Schwangere — schwangeres Personal muss von der Arbeit mit L. monocytogenes ausgeschlossen werden
- Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille obligatorisch
- Alle Abfälle müssen vor der Entsorgung autoklaviert werden (121°C/20 Min.)
- Desinfektion des Arbeitsplatzes nach Gebrauch: 70% Ethanol + 0,5% Natriumhypochlorit-Lösung
- Schafblut — potenzielle Allergenquelle, vorsichtig handhaben