🦠 Bestimmung der Anzahl somatischer Zellen in Rohmilch und chemisch konservierter Milch mit dem mikroskopischen Verfahren (Referenzverfahren) — 0,01 ml Probe auf einer Fläche von 1 cm² eines Objektträgers verteilt, Trocknen, Färben mit Newman-Lampert-Lösung (≥ 15 min) oder Ethidiumbromid (Fluoreszenzmikroskop), Zählen der kernhaltigen Zellen in einer festgelegten Fläche und Umrechnung mit dem Arbeitsfaktor in Zellen je Milliliter, PN-EN ISO 13366-1

Mikrobiologie PN-EN ISO 13366-1

Übersicht

WAS DIE NORM BESCHREIBT. Anwendungsbereich von der PKN-Katalogkarte PN-EN ISO 13366-1:2009 (polnische Fassung), vollständig (unsere Übersetzung): „Beschrieben wird ein Verfahren zur Zählung somatischer Zellen in Rohmilch und chemisch konservierter Milch. Das Verfahren ist zur Herstellung von Standardprüfproben und zur Bestimmung von Werten des Referenzverfahrens bestimmt, die für die Kalibrierung von Verfahren zur mechanischen und automatischen Bestimmung der Anzahl somatischer Zellen erforderlich sind. Das Verfahren umfasst: Definition, Verfahrensprinzip, Beschreibung der Reagenzien, Geräte, Vorbereitung der Prüfproben, Bestimmung sowie Berechnung und Angabe der Ergebnisse“. Den Normtext lesen wir in der Leseprobe von ISO 13366-1:2008 | IDF 148-1:2008 vom Deckblatt bis zum Ende von 8.1.1 (Seite 5); 8.1.2 (Färbung mit Ethidiumbromid), 8.2 (Zählung), die Abschnitte 9–11 (Berechnung, Präzision, Prüfbericht) und die Anhänge A–C haben wir nicht.

NACH DEM TEXT VON ISO 13366-1:2008 (Vorworte, Abschnitte 1–8.1.1). Die Norm wurde von ISO/TC 34/SC 5 (Milch und Milcherzeugnisse) und dem Internationalen Milchwirtschaftsverband (IDF) erarbeitet. Die zweite Ausgabe ist eine technische Überarbeitung von ISO 13366-1:1997 und ersetzt auch IDF 148A:1995; Teil 2 der Reihe ist ein Leitfaden für fluoro-opto-elektronische Zählgeräte. Anwendungsbereich: mikroskopisches (Referenz-)Verfahren für rohe und chemisch konservierte Milch; anwendbar auf Kuhmilch, sofern die genannten Voraussetzungen erfüllt sind; geeignet zur Herstellung von Standardproben und Referenzwerten für die Kalibrierung mechanisierter und automatisierter Verfahren. Definition (2.1): somatische Zellen sind Zellen mit Kern, d. h. alle Leukozyten und Epithelzellen, bestimmt nach dieser Norm. Prinzip (3): eine Prüfportion Milch wird auf einem Objektträger zu einem Ausstrich verteilt, getrocknet, die Zellen werden gefärbt und unter dem Mikroskop gezählt; die Zellzahl einer festgelegten Fläche, multipliziert mit einem Arbeitsfaktor, ergibt die Zellzahl je Milliliter. Farbstoffe (4.1, mit dem Warnhinweis, dass Tetrachlorethan giftig und Ethidiumbromid mutagen ist — Herstellung und Färbung im Abzug): modifizierte Newman-Lampert-Lösung (Modifikation nach Levowitz-Weber) — Ethanol 95 % 54,0 ml, Tetrachlorethan 40,0 ml (alternativ Xylol in gleicher Menge), Methylenblau 0,6 g, Eisessig 6,0 ml; die Mischung wird im Wasserbad auf 65 °C erwärmt, auf 4 °C abgekühlt, die Säure zugegeben, filtriert und vor Gebrauch erneut filtriert. Ethidiumbromid: Stammlösung 0,25 g in 100 ml Wasser (bis zu zwei Monate im Dunkeln bei 2 °C ± 2 °C), Puffer aus Kaliumhydrogenphthalat 0,51 g und Kaliumhydroxid 0,162 g in 100 ml, Arbeitslösung 2 ml Stammlösung + 8 ml Puffer + 0,1 ml Triton X-100 + 90 ml Wasser, unmittelbar vor Gebrauch herzustellen. Phosphatpuffer PBS (4.2): NaCl 8 g, KCl 0,2 g, Na₂HPO₄·7H₂O 1,15 g, KH₂PO₄ 0,2 g in 1000 ml, pH 7,2 ± 0,1 (handelsüblicher zulässig). Geräte (5): Wasserbäder 40, 50 und 65 °C (± 2 °C); Filter 10–12 µm; Mikroskop mit 500–1000-facher Vergrößerung (bei Ethidiumbromid mit Fluoreszenzeinrichtung); Mikrospritze 0,01 ml mit einer Toleranz von höchstens 2 %; Mikrometer mit Zertifikat; Objektträger mit einer Fläche von 1 cm² ± 5 % (95–105 mm²), rechteckig oder rund, oder Schablone 20 mm × 5 mm bzw. 11,28 mm Durchmesser; obere und untere Innenbreite sowie linke und rechte Innenhöhe der Fläche (bei runder Fläche senkrechter und waagerechter Durchmesser) sollten um höchstens 0,2 mm voneinander abweichen. Probenahme (6) ist nicht Teil des Verfahrens — empfohlen wird ISO 707 | IDF 50. Lagerung (7.1): 4 °C ± 2 °C und Prüfung innerhalb von 6 h nach der Probenahme; bei längerer Lagerung Konservierungsmittel — Borsäure höchstens 0,6 g, Bronopol höchstens 0,05 g, Kaliumdichromat höchstens 0,1 g je 100 ml Probe — und Lagerung bei 4 °C ± 2 °C höchstens 6 Tage. Vorbereitung (7.2): im Wasserbad auf 40 °C erwärmen, mischen, auf die Kalibriertemperatur der Mikrospritze abkühlen (z. B. 20 °C); Proben über 1 000 000 Zellen/ml werden mit Puffer auf etwa 500 000 Zellen/ml verdünnt (im Text von ISO 13366-1:2008 lautet der Faktor d = Vs/(Vs × Vb) — im Nenner ein Multiplikationszeichen, obwohl man für einen Verdünnungsfaktor die Summe Vs + Vb erwarten würde; ob die Berichtigung AC:2009 das ändert, haben wir nicht geprüft; d, Vs und Vb notieren). Bestimmung (8): mindestens zwei Ausstriche je Probe, der bessere wird gezählt; Objektträger in 95 % Ethanol tauchen, abflammen und abkühlen; Färbung nach 8.1.1 oder 8.1.2 (Ziegenmilch — Anhang B). Nach 8.1.1: 0,01 ml Probe mit der Mikrospritze auf die 1-cm²-Fläche, mit der Nadel gleichmäßig über die ganze Fläche einschließlich des Randes verteilen, bei Raumtemperatur trocknen, mindestens 15 min in Newman-Lampert-Lösung tauchen, trocknen, vorsichtig mit Leitungswasser spülen, trocknen und vor Staub schützen.

STATUS (Stand der PKN-Katalogkarten 02.10.2026). Die Karte PN-EN ISO 13366-1:2009 (polnische Fassung, veröffentlicht 17-02-2009, 21 Seiten, Preisgruppe L) hat keinen Vermerk „Zurückgezogen“: Sektor Lebensmittel, Landwirtschaft und Forstwirtschaft, KT 35 Milch und Milcherzeugnisse, ICS 67.100.10, „Führt ein: EN ISO 13366-1:2008 [IDT], ISO 13366-1:2008 [IDT]“, „Ersetzt: PN-EN ISO 13366-1:2008 – englische Fassung“, Zusatzelemente: PN-EN ISO 13366-1:2009/AC:2009 und PN-EN ISO 13366-1:2009/Ap1:2009. Die Karte der englischen Fassung PN-EN ISO 13366-1:2008 trägt den Vermerk „Zurückgezogen“ (zurückgezogen 17-02-2009, ersetzt durch die polnische Fassung 2009). Die PKN-Suche nach „PN-EN ISO 13366-1“ (02.10.2026) zeigt auch PN-EN ISO 13366-1:2000 (polnische Fassung).

WIE VIELE LABORATORIEN UND IN WELCHER FORM (Kopie der Datenbank der Akkreditierungsumfänge, Datenstand bis 17.09.2026, gelesen 02.10.2026). Die Nummer 13366-1 steht in 7 Datensätzen bei 7 Laboratorien: AB 485, AB 545, AB 546, AB 585, AB 604, AB 620, AB 685. In den aktuellen Umfängen auf den PCA-Seiten (gelesen 02.10.2026, Ausgaben vom 14.10.2025 bis 19.08.2026) nennen alle die Ausgabe 2009 zusammen mit Korrekturen: AC:2009 und Ap1:2009 (AB 545, AB 546, AB 585, AB 604, AB 620, AB 685 — in unterschiedlicher Reihenfolge, AB 685 in drei getrennten Zeilen) oder nur AC:2009 (AB 485). Die Registerkarte „Laboratorien“ sucht Einträge, die MIT „PN-EN ISO 13366-1“ BEGINNEN, und zeigt alle 7 Laboratorien — geprüft mit der Abfrage der Registerkarte auf dem Produktionsserver labcoda.pl am 02.10.2026.

WAS DIE LABORATORIEN PRÜFEN (PCA-Positionen). Immer „Rohmilch“ („Rohe Kuhmilch“ bei AB 604, „Milch“ bei AB 485) — „Anzahl somatischer Zellen, mikroskopisches Verfahren“. Einen Bereich geben zwei Laboratorien an: AB 485 von 100 000 bis 2 000 000 Zellen/ml, AB 685 ab 10 000 Zellen/ml; die übrigen fünf — ohne Bereich. AB 485 hat daneben dasselbe Merkmal nach Teil 2 (PN-EN ISO 13366-2:2007, fluoro-opto-elektronisches Verfahren, von 1000 bis 1 000 000 Zellen/ml) — die Anordnung, für die das mikroskopische Verfahren die Referenz ist.

WO LEICHT EIN SCHEINBAR RICHTIGES ERGEBNIS ENTSTEHT. Probenahme und Lagerung: eine Probe ohne Konservierungsmittel ist innerhalb von 6 h zu prüfen, eine konservierte — höchstens 6 Tage bei 4 °C ± 2 °C; die Norm nennt Obergrenzen für Konservierungsmittel (Borsäure 0,6 g, Bronopol 0,05 g, Kaliumdichromat 0,1 g je 100 ml) und für die Lagerdauer — ein Ergebnis aus einer Probe außerhalb dieser Grenzen erfüllt die Bedingungen des Verfahrens nicht, obwohl es für sich unauffällig aussieht. Messung: das Volumen 0,01 ml dosiert eine Mikrospritze mit 2 % Toleranz, und die Norm verlangt, die Probe auf die Temperatur abzukühlen, bei der die Mikrospritze kalibriert wurde (7.2) — das Auslassen dieses Schritts verändert das dosierte Volumen, von dem die Umrechnung auf den Milliliter abhängt; die Fläche des Objektträgers beträgt 1 cm² ± 5 %, ihre gegenüberliegenden Maße (Breiten, Höhen oder Durchmesser) sollten um höchstens 0,2 mm voneinander abweichen — ein Objektträger mit anderer Fläche erfordert eine Neuberechnung des Arbeitsfaktors; die Milch ist auch am Rand der Fläche zu verteilen. Berechnung: eine Probe über 1 000 000 Zellen/ml wird mit Puffer auf etwa 500 000 Zellen/ml verdünnt und d, Vs und Vb werden notiert, die Formel für d ist in der Ausgabe mit Berichtigung AC:2009 zu prüfen (im Text von ISO 13366-1:2008 steht im Nenner Vs × Vb) — die Verdünnung ist in der Berechnung nach Abschnitt 9 zu berücksichtigen, den wir nicht haben. Rolle des Verfahrens: es ist das Referenzverfahren für automatische Zählgeräte (eigener Eintrag zu PN-EN ISO 13366-2) — mikroskopische Werte dienen deren Kalibrierung, nicht umgekehrt. Bereich: AB 685 gibt einen Bereich ab 10 000 Zellen/ml an, AB 485 ab 100 000 Zellen/ml; Bestimmungsgrenzen nennt die Norm im gelesenen Teil nicht.

WAS WIR NICHT ANGEBEN. Wir haben 8.1.2 und 8.2 sowie die Abschnitte 9–11 nicht: die schrittweise Färbung mit Ethidiumbromid, die Anzahl der zu zählenden Felder oder Streifen, die Formeln für den Arbeitsfaktor (Rechteck — aufeinanderfolgende Felder oder Streifen, Kreis — aufeinanderfolgende Felder), die Wiederhol- und Vergleichgrenzen und den Inhalt des Prüfberichts; auch die Anhänge A (Ringversuch), B (Färbung von Ziegenmilch) und C (Poisson-Verteilung) fehlen. Wir geben daher keine Präzisionsangabe und keine Mindestzahl zu zählender Zellen an.

Prinzip der Methode

0,01 ml Milch (mit Puffer verdünnt, wenn die Zellzahl 1 000 000/ml übersteigt) werden auf einer Fläche von 1 cm² eines Objektträgers verteilt, getrocknet und gefärbt (Newman-Lampert oder Ethidiumbromid); kernhaltige Zellen werden unter dem Mikroskop in einer festgelegten Fläche gezählt und mit dem Arbeitsfaktor multipliziert, was die Zellzahl je Milliliter ergibt.

Anwendungen

• Rohmilch — Anzahl somatischer Zellen mit dem mikroskopischen Verfahren; 7 Laboratorien in PCA-Umfängen
• Referenzwerte und Standardproben zur Kalibrierung automatischer Zählgeräte (PN-EN ISO 13366-2)
• Chemisch konservierte Milch (Borsäure, Bronopol, Kaliumdichromat), höchstens 6 Tage gelagert

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 13366-1:2009 (wersja polska; EN ISO 13366-1:2008 IDT, ISO 13366-1:2008 IDT) z PN-EN ISO 13366-1:2009/AC:2009 i PN-EN ISO 13366-1:2009/Ap1:2009

Titel (PL)

Mleko — Oznaczanie liczby komórek somatycznych — Część 1: Metoda mikroskopowa (Metoda odniesienia)

Title (EN)

Milk — Enumeration of somatic cells — Part 1: Microscopic method (Reference method)

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probe

   Bei 4 °C ± 2 °C lagern; innerhalb von 6 h prüfen oder konservieren und höchstens nach 6 Tagen prüfen. PN-EN ISO 13366-1:2009 gültig (PKN-Karten, Stand 02.10.2026).

2. Vorbereitung

   Im Wasserbad auf 40 °C erwärmen, mischen, auf die Kalibriertemperatur der Mikrospritze abkühlen; Proben > 1 000 000 Zellen/ml mit Puffer auf ca. 500 000/ml verdünnen und d, Vs, Vb notieren.

3. Ausstrich

   Mindestens zwei Ausstriche: 0,01 ml auf die 1-cm²-Fläche eines entfetteten (95 % Ethanol, Abflammen) Objektträgers, gleichmäßig über die ganze Fläche einschließlich Rand; bei Raumtemperatur trocknen.

4. Färbung

   Newman-Lampert-Lösung mindestens 15 min, Trocknen, Spülen mit Leitungswasser, Trocknen (8.1.1); oder Ethidiumbromid nach 8.1.2 (diesen Unterabschnitt haben wir nicht).

5. Zählung und Ergebnis

   Zellen im besseren Ausstrich unter dem Mikroskop zählen und mit dem Arbeitsfaktor nach Abschnitt 9 in Zellen/ml umrechnen (die Formeln haben wir nicht).

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Tetrachlorethan ist giftig und Ethidiumbromid mutagen — Lösungen im Abzug herstellen und färben, mit Schutzausrüstung; verschüttete Mengen deaktivieren (4.1)
• Kaliumdichromat als Konservierungsmittel sollte auf Proben mit langer Lagerdauer beschränkt werden (7.1)
• FACHLICHER HINWEIS: Referenzverfahren zur Kalibrierung automatischer Zählgeräte; Probe ohne Konservierungsmittel — innerhalb von 6 h, mit Konservierungsmittel — höchstens 6 Tage bei 4 °C ± 2 °C

Häufige Fragen