🔴 Legionellen im Wasser
Nachweis und quantitative Bestimmung von Legionella-Bakterien im Wasser mittels Kulturmethode auf BCYE/GVPC-Medium mit Hitze- oder Säurebehandlung. Die einzige vom Gesundheitsamt anerkannte Methode.
Übersicht
Legionella ist eine Gattung gramnegativer Stäbchenbakterien, von denen Legionella pneumophila am gefährlichsten für den Menschen ist — der Erreger der Legionellose (Legionärskrankheit), einer schweren Lungenentzündung mit 5–30 % Letalität. Legionella-Bakterien besiedeln natürlicherweise die aquatische Umgebung, stellen jedoch ein Gesundheitsrisiko dar, wenn sie sich in künstlichen Wassersystemen vermehren: Warmwasserinstallationen, Kühltürme, Brunnen, Whirlpools, Luftbefeuchter und Klimaanlagen.
Die Infektion erfolgt durch Inhalation — durch Einatmen von Wasseraerosol, das Bakterien enthält. Legionellen werden nicht von Mensch zu Mensch übertragen. Optimale Vermehrungstemperatur: 25–45°C, mit Maximum bei 35–37°C. Unter 20°C wachsen die Bakterien nicht, über 60°C sterben sie ab.
Die Kulturmethode nach PN-EN ISO 11731:2017 ist die einzige vom Staatlichen Gesundheitsamt in Polen anerkannte Methode. Sie umfasst Membranfiltration oder Direktausstrich, vorläufige Probenbehandlung (Hitze 50°C/30 min oder Säure pH 2,2/5 min) zur Eliminierung der Begleitflora, Kultur auf GVPC-Medium (selektiv) und BCYE (nicht-selektiv) bei 36±1°C in feuchter Atmosphäre für 7–10 Tage.
Die Untersuchung ist gemäß der Verordnung des Gesundheitsministers über die Wasserqualität in internen Installationen vorgeschrieben (≤100 KBE/100 mL — keine Maßnahmen, >100 — Reinigung und Desinfektion, >1000 — sofortige Korrekturmaßnahmen). Wartezeit auf Ergebnisse: 9–15 Tage, was der Hauptnachteil der Kulturmethode ist.
Prinzip der Methode
Die Wasserprobe wird durch Membranfiltration (0,2 µm) oder Zentrifugation konzentriert. Das Konzentrat wird einer Behandlung zur Eliminierung der Begleitflora unterzogen: Hitzebehandlung (50±1°C/30 min) oder Säurebehandlung (HCl/KCl-Puffer pH 2,2 für 5 min). Die Probe wird auf GVPC-Medium (BCYE-Agar mit Supplementen: Glycin, Polymyxin B, Vancomycin, Cycloheximid — hemmt Bakterien und Pilze) und auf BCYE-Medium ohne Supplemente (Kontrolle) ausgestrichen. Inkubation: 36±1°C in feuchter Atmosphäre (>80 % RH) für 7–10 Tage. Legionella-Kolonien: gräulich, glasig, mit „geschliffenes-Glas"-Struktur. Bestätigung: kein Wachstum auf BCYE ohne L-Cystein (Legionella benötigt L-Cystein für das Wachstum).
Anwendungen
- Überwachung von Warmwasserinstallationen (Krankenhäuser, Hotels, Mehrfamilienhäuser)
- Kontrolle von Kühltürmen und Klimaanlagen
- Untersuchung von Wasser in Schwimmbädern, Whirlpools, SPAs, Brunnen
- Epidemiologische Untersuchung — Legionellose-Ausbrüche
- Kontrolle der Wirksamkeit thermischer Desinfektion (>70°C) und chemischer Desinfektion
- Überwachung von Wasser in Gesundheitseinrichtungen (obligatorisch)
- Untersuchung von Wasser im Auftrag von Hausverwaltungen
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Ergebnis | KBE/100 mL (koloniebildende Einheiten) |
| Zulässiger Wert | ≤100 KBE/100 mL (keine Maßnahmen), >1000 — Alarm |
| Inkubationstemperatur | 36 ± 1°C |
| Inkubationszeit | 7–10 Tage (Ablesung nach 3, 5, 7 und 10 Tagen) |
| Atmosphäre | Aerob, Feuchtigkeit >80 % RH |
| Wartezeit auf Ergebnis | 9–15 Tage (mit Behandlung und Bestätigung) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 11731:2017
- Titel (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Legionella
- Title (EN)
- Water quality — Enumeration of Legionella
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenahme
Mind. 1 L Wasser entnehmen. Entnahmestelle NICHT vorspülen (kein Ablaufen lassen). Natriumthiosulfat hinzufügen (bei chloriertem Wasser). Transport bei 5–20°C, Analyse innerhalb 24 h.
2. Membranfiltration — Konzentrierung
1 L Probe durch 0,2-µm-Filter (Polycarbonat) filtrieren. Membran aseptisch schneiden, in sterilen Behälter mit 10 mL reservierter Probe geben. 2 min kräftig vortexen.
3. Hitzebehandlung
Konzentrierte Probe in 2 Portionen teilen. Eine im Wasserbad bei 50±1°C für 30 min erhitzen (Eliminierung hitzeempfindlicher Flora). Die andere unbehandelt belassen.
4. Säurebehandlung (alternativ)
Anstelle der Hitzebehandlung: HCl/KCl-Puffer (pH 2,2) im Verhältnis 1:1 hinzufügen. Kontaktzeit 5 min. Dann mit KOH-Puffer neutralisieren.
5. Ausstrich auf Medien
0,1 mL Probe (behandelt und unbehandelt) auf GVPC- und BCYE-Platten ausstreichen. Mit Glasspatel verteilen. Doppelt ausstrich.
6. Inkubation
Platten bei 36±1°C in feuchter Atmosphäre (>80 % RH) inkubieren. Dicht verschlossene Beutel oder Brutschrank mit Wasserwanne verwenden. Platten NICHT umdrehen.
7. Ablesung — Tag 3 und 5
Platten unter Stereomikroskop prüfen. Falls Begleitflora die GVPC-Platten überwächst — zusätzlichen Ausstrich mit erneuter Behandlung durchführen.
8. Ablesung — Tag 7 und 10
Kolonien mit typischer Morphologie zählen: gräulich, glasig, glänzend, mit „geschliffenes-Glas"-Struktur. Durchmesser 1–3 mm. Verdächtige Kolonien markieren.
9. Bestätigung — Subkultur
Verdächtige Kolonien auf BCYE mit L-Cystein und BCYE ohne L-Cystein übertragen. Bei 36°C/48 h inkubieren. Wachstum auf BCYE+Cystein und kein Wachstum auf BCYE−Cystein = Legionella spp.
10. Serogruppen-Identifizierung
Bestätigte Legionella-Kolonien mit Latextest (Agglutination) prüfen zur Identifizierung von L. pneumophila sg 1 (am häufigsten pathogen) und sg 2–14.
11. Ergebnisberechnung
Ergebnis = (Anzahl bestätigter Kolonien × Verdünnungsfaktor) / Probenvolumen. Angabe in KBE/100 mL oder KBE/L.
12. Qualitätskontrolle
Positivkontrolle: L. pneumophila ATCC 33152. Negativkontrolle: steriles Wasser. Brutschrankfeuchtigkeit und Mediensterilität prüfen.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Membranfiltrationsanlage (0,2 µm) | Sartorius Combisart, Merck EZ-Fit mit 0,2-µm-Filtern | 3 000–12 000 PLN |
| Brutschrank mit Feuchtigkeitsregelung | Binder KBF 115, Memmert HPP110 mit Wasserwanne | 8 000–25 000 PLN |
| Thermostatisches Wasserbad | Memmert WNB 14, Julabo CORIO C-B5 (50°C für Hitzebehandlung) | 5 000–15 000 PLN |
| Laborvortexer | IKA Vortex 3, Scientific Industries Vortex-Genie 2 | 1 500–4 000 PLN |
| Autoklav | Tuttnauer ELV 2540 | 20 000–45 000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank Klasse II | Esco Airstream Klasse II, Telstar Bio II Advance | 20 000–50 000 PLN |
| Stereomikroskop | Zeiss Stemi 305, Olympus SZ61 | 5 000–15 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| BCYE-Agar (Buffered Charcoal Yeast Extract) | — | Basismedium mit L-Cystein, Eisenpyrophosphat, Aktivkohle, Hefeextrakt, ACES-Puffer. Hersteller: Oxoid, Merck, bioMérieux |
| GVPC-Agar (Selektivsupplement) | — | BCYE + Glycin + Polymyxin B + Vancomycin + Cycloheximid. Hemmt die Begleitflora |
| BCYE ohne L-Cystein | — | Kontrollmedium — Legionella wächst nicht ohne L-Cystein. Zur Bestätigung |
| L-Cystein-Hydrochlorid | 52-89-1 | BCYE-Wachstumssupplement, Konzentration 0,4 g/L. Legionella benötigt L-Cystein |
| Saurer Puffer HCl/KCl pH 2,2 | — | Zur Säurebehandlung der Probe — Eliminierung der Begleitflora. Kontaktzeit 5 min |
| Membranfilter 0,2 µm (Polycarbonat) | — | Polycarbonat (PC), 47 mm, schwarz oder weiß. Zur Filtration von Legionella-Proben |
| Latextest-Reagenzien | — | Latexagglutinationstest zur Identifizierung von L. pneumophila Serogruppen (sg 1–14). Oxoid DR0800 |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Legionella pneumophila — BSL-2-Erreger! Alle Arbeiten in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II. FFP2/FFP3-Maske bei der Arbeit mit Aerosol
- Offene Röhrchen mit Probe NICHT vortexen — Gefahr der Erzeugung infektiösen Aerosols
- Saurer Puffer pH 2,2 — ätzend, Handschuhe und Schutzbrille verwenden
- Cycloheximid (in GVPC) — toxisch, mutagen. Kontakt vermeiden, im Abzug arbeiten
- Infektiöses Material — autoklavieren 121°C/30 min. Platten in autoklavierbaren Beuteln verpacken
- Wasserproben aus Installationen >40°C — Verbrennungsgefahr bei der Entnahme