🔴 Legionellen im Wasser

Mikrobiologie PN-EN ISO 11731

Übersicht

Legionella ist eine Gattung gramnegativer Stäbchenbakterien, von denen Legionella pneumophila am gefährlichsten für den Menschen ist — der Erreger der Legionellose (Legionärskrankheit), einer schweren Lungenentzündung mit 5–30 % Letalität. Legionella-Bakterien besiedeln natürlicherweise die aquatische Umgebung, stellen jedoch ein Gesundheitsrisiko dar, wenn sie sich in künstlichen Wassersystemen vermehren: Warmwasserinstallationen, Kühltürme, Brunnen, Whirlpools, Luftbefeuchter und Klimaanlagen.

Die Infektion erfolgt durch Inhalation — durch Einatmen von Wasseraerosol, das Bakterien enthält. Legionellen werden nicht von Mensch zu Mensch übertragen. Optimale Vermehrungstemperatur: 25–45°C, mit Maximum bei 35–37°C. Unter 20°C wachsen die Bakterien nicht, über 60°C sterben sie ab.

Die Kulturmethode nach PN-EN ISO 11731:2017 ist die einzige vom Staatlichen Gesundheitsamt in Polen anerkannte Methode. Sie umfasst Membranfiltration oder Direktausstrich, vorläufige Probenbehandlung (Hitze 50°C/30 min oder Säure pH 2,2/5 min) zur Eliminierung der Begleitflora, Kultur auf GVPC-Medium (selektiv) und BCYE (nicht-selektiv) bei 36±1°C in feuchter Atmosphäre für 7–10 Tage.

Die Untersuchung ist gemäß der Verordnung des Gesundheitsministers über die Wasserqualität in internen Installationen vorgeschrieben (≤100 KBE/100 mL — keine Maßnahmen, >100 — Reinigung und Desinfektion, >1000 — sofortige Korrekturmaßnahmen). Wartezeit auf Ergebnisse: 9–15 Tage, was der Hauptnachteil der Kulturmethode ist.

Prinzip der Methode

Die Wasserprobe wird durch Membranfiltration (0,2 µm) oder Zentrifugation konzentriert. Das Konzentrat wird einer Behandlung zur Eliminierung der Begleitflora unterzogen: Hitzebehandlung (50±1°C/30 min) oder Säurebehandlung (HCl/KCl-Puffer pH 2,2 für 5 min). Die Probe wird auf GVPC-Medium (BCYE-Agar mit Supplementen: Glycin, Polymyxin B, Vancomycin, Cycloheximid — hemmt Bakterien und Pilze) und auf BCYE-Medium ohne Supplemente (Kontrolle) ausgestrichen. Inkubation: 36±1°C in feuchter Atmosphäre (>80 % RH) für 7–10 Tage. Legionella-Kolonien: gräulich, glasig, mit „geschliffenes-Glas"-Struktur. Bestätigung: kein Wachstum auf BCYE ohne L-Cystein (Legionella benötigt L-Cystein für das Wachstum).

Anwendungen

• Überwachung von Warmwasserinstallationen (Krankenhäuser, Hotels, Mehrfamilienhäuser)
• Kontrolle von Kühltürmen und Klimaanlagen
• Untersuchung von Wasser in Schwimmbädern, Whirlpools, SPAs, Brunnen
• Epidemiologische Untersuchung — Legionellose-Ausbrüche
• Kontrolle der Wirksamkeit thermischer Desinfektion (>70°C) und chemischer Desinfektion
• Überwachung von Wasser in Gesundheitseinrichtungen (obligatorisch)
• Untersuchung von Wasser im Auftrag von Hausverwaltungen

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 11731:2017

Titel (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Legionella

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Legionella

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme

   Mind. 1 L Wasser entnehmen. Entnahmestelle NICHT vorspülen (kein Ablaufen lassen). Natriumthiosulfat hinzufügen (bei chloriertem Wasser). Transport bei 5–20°C, Analyse innerhalb 24 h.

   ⏱ Zeit: 10 min

2. Membranfiltration — Konzentrierung

   1 L Probe durch 0,2-µm-Filter (Polycarbonat) filtrieren. Membran aseptisch schneiden, in sterilen Behälter mit 10 mL reservierter Probe geben. 2 min kräftig vortexen.

   ⏱ Zeit: 15 min

3. Hitzebehandlung

   Konzentrierte Probe in 2 Portionen teilen. Eine im Wasserbad bei 50±1°C für 30 min erhitzen (Eliminierung hitzeempfindlicher Flora). Die andere unbehandelt belassen.

   ⏱ Zeit: 35 min • 🌡 Temperatur: 50 ± 1°C

4. Säurebehandlung (alternativ)

   Anstelle der Hitzebehandlung: HCl/KCl-Puffer (pH 2,2) im Verhältnis 1:1 hinzufügen. Kontaktzeit 5 min. Dann mit KOH-Puffer neutralisieren.

   ⏱ Zeit: 10 min

5. Ausstrich auf Medien

   0,1 mL Probe (behandelt und unbehandelt) auf GVPC- und BCYE-Platten ausstreichen. Mit Glasspatel verteilen. Doppelt ausstrich.

   ⏱ Zeit: 10 min

6. Inkubation

   Platten bei 36±1°C in feuchter Atmosphäre (>80 % RH) inkubieren. Dicht verschlossene Beutel oder Brutschrank mit Wasserwanne verwenden. Platten NICHT umdrehen.

   ⏱ Zeit: 7–10 Tage • 🌡 Temperatur: 36 ± 1°C

7. Ablesung — Tag 3 und 5

   Platten unter Stereomikroskop prüfen. Falls Begleitflora die GVPC-Platten überwächst — zusätzlichen Ausstrich mit erneuter Behandlung durchführen.

   ⏱ Zeit: 15 min

8. Ablesung — Tag 7 und 10

   Kolonien mit typischer Morphologie zählen: gräulich, glasig, glänzend, mit „geschliffenes-Glas"-Struktur. Durchmesser 1–3 mm. Verdächtige Kolonien markieren.

   ⏱ Zeit: 20 min

9. Bestätigung — Subkultur

   Verdächtige Kolonien auf BCYE mit L-Cystein und BCYE ohne L-Cystein übertragen. Bei 36°C/48 h inkubieren. Wachstum auf BCYE+Cystein und kein Wachstum auf BCYE−Cystein = Legionella spp.

   ⏱ Zeit: 48 h • 🌡 Temperatur: 36°C

10. Serogruppen-Identifizierung

    Bestätigte Legionella-Kolonien mit Latextest (Agglutination) prüfen zur Identifizierung von L. pneumophila sg 1 (am häufigsten pathogen) und sg 2–14.

    ⏱ Zeit: 15 min

11. Ergebnisberechnung

    Ergebnis = (Anzahl bestätigter Kolonien × Verdünnungsfaktor) / Probenvolumen. Angabe in KBE/100 mL oder KBE/L.

12. Qualitätskontrolle

    Positivkontrolle: L. pneumophila ATCC 33152. Negativkontrolle: steriles Wasser. Brutschrankfeuchtigkeit und Mediensterilität prüfen.

    ⏱ Zeit: 15 min

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Legionella pneumophila — BSL-2-Erreger! Alle Arbeiten in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II. FFP2/FFP3-Maske bei der Arbeit mit Aerosol
• Offene Röhrchen mit Probe NICHT vortexen — Gefahr der Erzeugung infektiösen Aerosols
• Saurer Puffer pH 2,2 — ätzend, Handschuhe und Schutzbrille verwenden
• Cycloheximid (in GVPC) — toxisch, mutagen. Kontakt vermeiden, im Abzug arbeiten
• Infektiöses Material — autoklavieren 121°C/30 min. Platten in autoklavierbaren Beuteln verpacken
• Wasserproben aus Installationen >40°C — Verbrennungsgefahr bei der Entnahme

Häufige Fragen