🦠 Somatische Zellen in Rohmilch — fluoreszenzoptoelektronische Zählgeräte (Scheiben- oder Durchflusszytometrie)

Mikrobiologie PN-EN ISO 13366-2

Übersicht

ISO 13366-2 | IDF 148-2:2006 gibt Leitlinien für die Arbeitsbedingungen beim Zählen der somatischen Zellen in roher und chemisch konservierter Milch mit fluoreszenzoptoelektronischen Zählgeräten an, in deren Zählteil die Technik der rotierenden Scheibe oder die Durchflusszytometrie angewendet wird; sie betrifft Kuhmilch sowie auch Ziegen-, Schaf- und Büffelmilch, sofern bestimmte Vorbedingungen erfüllt sind. Die Ausgabe ersetzte ISO 13366-2:1997 und ISO 13366-3:1997 sowie IDF 148A:1995 (Verfahren B und C). Somatische Zellen werden als Zellen definiert, die infolge der Färbung der DNA in den Kernen eine Fluoreszenz oberhalb der Schwelle zeigen; die Zellzahl wird in Zellen je ml angegeben. Das Bezugsverfahren ist das mikroskopische Verfahren ISO 13366-1 | IDF 148-1; die Kalibrierung und die Qualitätskontrolle stützen sich auf ISO 8196-1/-2 (Richtigkeit der indirekten Verfahren), auf Referenzmaterialien (ISO Guide 34) und auf Eignungsprüfungen (ISO Guide 43-1). Die Verordnung (EG) Nr. 853/2004 (Anhang III Abschnitt IX) legt für rohe Kuhmilch das Kriterium einer Zahl somatischer Zellen von ≤ 400 000/ml (gleitender geometrischer Mittelwert) neben einer Keimzahl bei 30 °C von ≤ 100 000/ml fest und lässt für bestimmte Käse mit Zustimmung der Behörden Ausnahmen zu. Geräte wie Fossomatic (FOSS) erklären die Übereinstimmung mit ISO 13366-2 / IDF 148-2:2006 und die MicroVal-Zertifizierung für das Zählen somatischer Zellen in roher Kuhmilch.

Prinzip der Methode

Die fluoreszenzoptoelektronischen Zählgeräte verfügen über Funktionen zur Entnahme der Reagenzien und der Probe, über einen Mischteil und einen Zählteil. Im Mischteil werden streng kontrollierte Volumina der Probe sowie der Puffer- und Farbstofflösung dosiert und gemischt (im Becher, in der Kammer, in der Zentrifuge, in der Probenschleife oder in der Leitung zur Durchflusszelle); ein Teil des Gemisches gelangt in die Objektebene des Zählteils. Jedes gefärbte Teilchen, das im Fluoreszenzmikroskop beobachtet wird, erzeugt einen elektrischen Impuls, der gefiltert, verstärkt und aufgezeichnet wird; die Verteilung der Impulshöhen wird elektronisch verarbeitet, wobei das Rauschen von den den Zellen zugeordneten Impulsen unterschieden wird — die Diskriminatorschwelle kann fest oder dynamisch sein. In der Scheibenzytometrie wird ein dünner Film des Gemisches mit einer Düse auf die Oberseite einer senkrechten rotierenden Scheibe aufgebracht, die die bewegliche Objektebene bildet; in der Durchflusszytometrie wird ein Teil des Gemisches in einen schnellen Strom der Hüllflüssigkeit in einer kapillaren Durchflusszelle eingeführt, wo es nach der Beschleunigung einen dünnen Faden mit dynamisch fokussierten Zellen bildet, der am Objektiv vorbeizieht. Zweikanalgeräte werden wie zwei getrennte Geräte behandelt. Ergebnis = gezählte Zahl × Arbeitsfaktor (ein niedrigerer Faktor begünstigt die Präzision); von Bedeutung ist das Verhältnis des Volumens von Puffer/Farbstoff zur Probe. Faktoren, die das Ergebnis beeinflussen: Flaschen (dicht, richtiges Leervolumen — ein zu großes begünstigt das Ausbuttern, ein zu kleines erschwert das Mischen), Probenahme (sorgfältiges Mischen der Sammelmilch — die Zellen sammeln sich in der oberen und der unteren Schicht an; bei Proben von Einzeltieren eine repräsentative Probe des gesamten Gemelks), Kühlung auf 0–6 °C ohne Einfrieren, Zählen bis 96 h (Einfrieren und Auftauen senken das Ergebnis um 10–20 %), Konservierung innerhalb von 24 h (Borsäure ≤ 0,6 g/100 ml — 24 h bei 6–12 °C; Natriumazid ≤ 0,024 g/100 ml — 72 h bei 2–10 °C; Bronopol ≤ 0,05 g/100 ml — 6 Tage bei 2–12 °C; Kaliumdichromat ≤ 0,2 g/100 ml — 6 Tage bei 2–12 °C; Farbmarker: Patent Blue V ≤ 0,15 mg/100 ml, Yellow Orange S ≤ 1 mg/100 ml, Gemisch Patent Blue V + Eosin B), störende Substanzen (Konservierungsmittel und Farbmarker oberhalb der Grenzwerte, Methylenblau > 0,06 mg/100 ml), Zelllyse (Verschiebung der Impulsverteilung nach links — zu niedriges Ergebnis), problematische Proben (Milch aus einer akuten Euterentzündung mit Gerinnseln, verunreinigte Milch, Milch mit einer hohen Zahl von Erythrozyten, Kolostrum, Milch vom Ende der Laktation, saure Milch), Zustand des Geräts (Rührwerk, Durchgängigkeit des Weges, Lichtquelle und Photomultiplier; bei Scheibengeräten — Lage des Films, Sauberkeit der Objektebene und des Reinigungsschwamms; bei Durchflussgeräten — Verhalten des Probenfadens und Strömung der Hüllflüssigkeit). Reagenzien von analytischer und bakteriologischer Qualität, entmineralisiertes Wasser < 10 µS/cm.

Anwendungen

• Routinemäßige Beurteilung der Rohmilch in Milchprüflaboratorien (Anlieferung) — Kriterium ≤ 400 000 Zellen/ml nach der Verordnung (EG) Nr. 853/2004
• Beurteilung der Leistung von Milchkühen — Proben von Einzeltieren (Diagnostik des Euterzustands, Mastitis)
• Ziegen-, Schaf- und Büffelmilch nach der Erfüllung der Vorbedingungen der Norm
• Laboratorien der Molkereien — Kontrolle des Rohstoffs bei der Annahme; Kopplung mit Zusammensetzungsanalysatoren (CombiFoss) unter Berücksichtigung des Einflusses der Konservierungsmittel
• Eignungsprüfungen und Kalibrierung gegenüber dem mikroskopischen Verfahren ISO 13366-1

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 13366-2:2007 (ISO 13366-2:2006 | IDF 148-2:2006)

Titel (PL)

Mleko — Oznaczanie liczby komórek somatycznych — Część 2: Przewodnik obsługi liczników fluoro-opto-elektronicznych

Title (EN)

Milk — Enumeration of somatic cells — Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme

   Verwende saubere, trockene, dichte Flaschen mit richtigem Leervolumen; mische die Sammelmilch sorgfältig (die Zellen sammeln sich in der oberen und der unteren Schicht an); entnimm bei Einzeltieren eine repräsentative Probe des gesamten Gemelks (für diagnostische Zwecke — aus einem Teil des Gemelks).

2. Kühlung oder Konservierung

   Kühle die Proben sofort auf 0–6 °C ab und friere sie nicht ein; zähle innerhalb von 96 h. Ist eine Konservierung erforderlich — gib innerhalb von 24 h ein Konservierungsmittel in zulässiger Konzentration zu (Borsäure, Azid, Bronopol oder Dichromat) mit einem etwaigen Farbmarker und bewahre unter den angegebenen Bedingungen auf; prüfe die Abwesenheit von Störungen für das verwendete Gerät.

3. Kontrolle des Geräts

   Prüfe das Rührwerk, die Durchgängigkeit des Weges (Gerinnsel, Verunreinigungen, Ablagerungen), die Lichtquelle, den Photomultiplier und die Verstärkung; bei Scheibenzählgeräten — die Lage des Films, die Sauberkeit der Objektebene und den Austausch des Schwamms, das Entleeren des Gefäßes für die Spülflüssigkeit; bei Durchflussgeräten — das Verhalten des Probenfadens und die Strömung der Hüllflüssigkeit.

4. Kalibrierung

   Kalibriere gegenüber dem mikroskopischen Verfahren ISO 13366-1 unter Verwendung von Referenzmaterialien (CRM nicht verfügbar; IRM aus einer Leukozytensuspension oder durch Mikrofiltration der Milch hergestellt, 5–8 Niveaus) nach ISO 8196-1/-2; beurteile jeden Kanal eines Zweikanalgeräts getrennt.

5. Messung

   Das Gerät dosiert und mischt die Probe mit Puffer/Farbstoff, bringt das Gemisch auf die Scheibe oder in die Durchflusszelle auf und zählt die Impulse oberhalb der Schwelle; vermeide problematische Proben (Gerinnsel, Kolostrum, saure Milch) und prüfe und reinige nach ihnen den Strömungsweg.

6. Ergebnis

   Gib die Zahl der somatischen Zellen je ml an (Zählung × Arbeitsfaktor); berechne für die rechtliche Beurteilung der Rohmilch den gleitenden geometrischen Mittelwert und vergleiche ihn mit 400 000/ml; nimm an Eignungsprüfungen teil (ISO Guide 43-1).

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Natriumazid und Kaliumdichromat (Konservierungsmittel) — giftig; Azid bildet in Abwasserleitungen explosive Metallazide; Dichromat — krebserzeugend
• DNA-bindende fluoreszierende Farbstoffe — mutagen, Handschuhe; Reagenzienabfälle nach den örtlichen Vorschriften
• Rohmilch kann Krankheitserreger enthalten (Listeria, Salmonella, Staphylokokken) — Arbeitshygiene

Häufige Fragen