🦠 Somatische Coliphagen im Wasser — Plaque-Verfahren mit zwei Agarschichten und einem Escherichia-coli-Wirtsstamm

Mikrobiologie PN-EN ISO 10705-2

Übersicht

Somatische Coliphagen sind Bakterienviren, die ausgewählte Stämme von Escherichia coli (und verwandte Stämme) infizieren, indem sie sich als ersten Schritt der Infektion an die Zellwand anlagern. In einem geschlossenen Rasen der Wirtsbakterien ergeben sie sichtbare Plaques — Aufhellungszonen. Sie sind gegen die Desinfektion widerstandsfähiger als Indikatorbakterien und überleben in beträchtlicher Entfernung von der Verunreinigungsquelle, weshalb sie als Indikator für das Vorhandensein enteraler Viren und als Werkzeug zur Beurteilung der Wirksamkeit der Virenentfernung in Aufbereitungsverfahren angesehen werden.

Die Norm beschreibt den Nachweis und die Bestimmung der Zahl somatischer Coliphagen durch Bebrütung der Probe mit einem geeigneten Wirtsstamm. Sie wird auf alle Arten von Wässern, auf Schlämme und Auszüge aus Klärschlämmen (nötigenfalls nach Verdünnung) sowie auf Auszüge aus Weichtieren angewendet. Bei einer geringen Zahl von Phagen ist eine vorherige Anreicherung der Probe nötig — die Norm (von 2000) kündigt im Anwendungsbereich ein gesondertes Dokument dazu an und nennt im Vorwort den Teil 3 der Reihe, „Concentration methods"; die Verordnung des Gesundheitsministers lässt dafür PN-EN ISO 10705-3 zu.

In Polen sind somatische Coliphagen als Betriebsparameter in die Rechtsvorschriften eingegangen. Die Verordnung des Gesundheitsministers vom 22. Mai 2026 (Gesetzblatt 2026 Pos. 748) lässt zu ihrer Bestimmung die Normen PN-EN ISO 10705-2 und PN-EN ISO 10705-3 zu und setzt in Anlage Nr. 7 Tabelle 2 einen Bezugswert von 50 pfu/100 ml für Rohwasser fest: die Überschreitung dieses Wertes verpflichtet dazu, nach den weiteren Aufbereitungsstufen eine Analyse durchzuführen, um den logarithmischen Entfernungswert zu ermitteln und zu beurteilen, ob das Risiko des Durchtritts krankheitserregender Viren beherrscht ist. Die Beschreibung in diesem Eintrag stammt aus dem Text der ISO 10705-2:2000 — der ersten und einzigen Ausgabe, von ISO in einer systematischen Überprüfung am 5. August 2021 bestätigt; eine weitere Überprüfung hat am 15. Juli 2026 begonnen und ist noch nicht abgeschlossen. Die polnische Übernahme dieser Norm (PN-EN ISO 10705-2, die EN ISO 10705-2 übernimmt) führen wir ohne Ausgabejahr an: die PKN-Katalogkarte ließ sich während der Bearbeitung dieses Eintrags nicht prüfen, weil der PKN-Shop damals nicht erreichbar war; in Laborveröffentlichungen erscheint die Bezeichnung mit dem Jahr 2005. EINE INNERHALB DIESES EINTRAGS FESTGEHALTENE UND NICHT GESCHLOSSENE ABWEICHUNG: im Quellenverzeichnis steht eine Position, die als Katalogkarte der PN-EN ISO 10705-2:2005 mit vollständigen Angaben beschrieben ist (Veröffentlichung 22-12-2005, 22 Seiten, KT 120, übernimmt EN ISO 10705-2:2001 [IDT] und ISO 10705-2:2000 [IDT], ohne die Felder „Datum der Zurückziehung" und „Ersetzt durch"). Wir entscheiden nicht, ob diese Angaben von der Karte selbst oder aus einer anderen Überlieferung stammen — solange wir die Karte nicht selbst gesehen haben, bleibt in der Überschrift die Bezeichnung ohne Jahr, und das Jahr 2005 gilt uns als unbestätigt. Nach PN-EN ISO 10705-2 durchgeführte Untersuchungen des NIZP–PZH wiesen somatische Coliphagen in 8 % der Rohwasserproben aus Grundwasserfassungen und in 89 % der Proben aus Oberflächenfassungen nach, wobei sie in keiner Probe aufbereiteten Wassers festgestellt wurden.

DER POLNISCHE TITEL IN DIESEM EINTRAG IST UNSERE ARBEITSÜBERSETZUNG, kein amtlicher Titel: der Titel wurde auf keiner PKN-Karte bestätigt, da der Shop nicht erreichbar war; in der Verordnung des Gesundheitsministers wird die Schreibweise „colifagi somatyczne" verwendet.

Prinzip der Methode

Die Probe wird mit einem kleinen Volumen halbfesten Wachstumsnährbodens gemischt. Eine Kultur des Wirtsstammes wird zugegeben und das Ganze auf einen festen Nährboden gegossen. Danach wird bebrütet und werden die Platten abgelesen, wobei die sichtbaren Plaques gezählt werden. Das Ergebnis wird als Zahl plaquebildender Teilchen ausgedrückt — pfp, auch plaquebildende Einheiten, pfu, genannt — je Volumeneinheit der Probe. Die Wahl des Wirtsstammes hängt von der bakteriellen Verunreinigung der Probe ab: für Wässer mit geringem Bakteriengehalt wird E. coli Stamm C verwendet, für stark verunreinigte Wässer und Abwässer — eine gegen Nalidixinsäure beständige Mutante, was es erlaubt, den bakteriellen Hintergrund der Probe zu unterdrücken.

Anwendungen

• Betriebsüberwachung des Rohwassers nach Gesetzblatt 2026 Pos. 748 — Bezugswert 50 pfu/100 ml
• Beurteilung der Wirksamkeit der Wasseraufbereitung hinsichtlich der Entfernung enteraler Viren (logarithmischer Entfernungswert nach den einzelnen Barrieren)
• Oberflächen- und Grundwasser, das von Wasserwerken gefasst wird
• Abwässer und stark verunreinigte Wässer — unter Verwendung eines gegen Nalidixinsäure beständigen Wirtsstammes
• Schlämme und Auszüge aus Klärschlämmen (nötigenfalls nach Verdünnung)
• Auszüge aus Weichtieren — die Norm nennt sie im Anwendungsbereich ausdrücklich

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 10705-2:2005 (EN ISO 10705-2:2001 [IDT], ISO 10705-2:2000 [IDT]; zastępuje PN-EN ISO 10705-2:2002 — wersję angielską)

Titel (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakteriofagów — Część 2: Oznaczanie ilościowe colifagów somatycznych

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages — Part 2: Enumeration of somatic coliphages

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme und Transport der Probe

   Die Proben nach ISO 8199 sowie ISO 5667-1, -2 und -3 entnehmen und ins Laboratorium bringen. In der Praxis des NIZP–PZH wurden die Proben in sterile Polypropylenflaschen mit Zusatz von Natriumthiosulfat nach PN-EN ISO 19458 entnommen, gekühlt befördert und bis zur Untersuchung nicht länger als 48 h bei 5 ± 3 °C aufbewahrt.

   🌡 Temperatur: 5 ± 3 °C

2. Wahl des Wirtsstammes

   Für Proben mit geringem Bakteriengehalt (Trinkwasser, unverunreinigte natürliche Wässer) E. coli Stamm C, ATCC 13706, verwenden. Für Proben mit einer großen Zahl von Bakterien (verunreinigte natürliche Wässer, Abwässer) die gegen Nalidixinsäure beständige Mutante E. coli Stamm CN, ATCC 700078 (WG5), verwenden.

3. Stammkultur des Wirtsstammes

   Den Inhalt der lyophilisierten Ampulle des Referenzstammes in etwa 3 ml MSB-Bouillon mit einer Pasteurpipette rekonstituieren, in einen 300-ml-Erlenmeyerkolben mit (50 ± 5) ml MSB überführen und unter mildem Schütteln bebrüten. 10 ml steriles Glycerin zugeben (Endkonzentration 15–20 Vol.-%), mischen, zu je etwa 0,5 ml in Fläschchen abfüllen und bei (−70 ± 10) °C oder in flüssigem Stickstoff aufbewahren.

   ⏱ Zeit: (20 ± 4) h • 🌡 Temperatur: (36 ± 2) °C

4. Arbeitskulturen und Schütteln

   Die Kulturen auf den weiteren Stufen unter mildem Schütteln führen — außer einem schnelleren Wachstum stellt das sicher, dass alle Zellen in der Wachstumsphase sind und keine Zellen der stationären Phase auftreten, die die Ausbeute der Aussaat herabsetzen. Ohne Schüttler die Inokulationskulturen mehrfach von Hand schütteln.

5. Kalibrierung der Messung der Kulturdichte

   Die Extinktionsmessungen gegen die Zahl lebender Zellen kalibrieren (Abschnitt 10.2 der Norm), unter Verwendung eines Spektralphotometers mit einem Filter im Bereich 500–650 nm sowie von 1-cm-Küvetten oder nephelometrischen Kolben mit Seitenarm.

6. Verdünnungen der Probe

   Nötigenfalls Verdünnungen der Probe in Pepton-Salz-Lösung oder in einem anderen Verdünnungsmittel nach ISO 6887 herstellen. Die Norm lässt auch die Untersuchung von Auszügen aus Schlämmen und aus Weichtieren nach Verdünnung zu.

7. Zweischicht-Aussaat

   Die Probe mit einem kleinen Volumen halbfesten Wachstumsnährbodens mischen, die Kultur des Wirtsstammes zugeben und das Ganze auf den festen Nährboden in der Petrischale gießen. Bei der Ausrüstung nennt die Norm ein Wasserbad oder einen auf (45 ± 1) °C eingestellten Heizblock sowie ein gesondertes Bad zum Schmelzen der Agarnährböden.

8. Bebrütung und Ablesen

   Die Platten in einem auf (36 ± 2) °C eingestellten Brutschrank oder Wasserbad bebrüten und danach ablesen, wobei die sichtbaren Plaques im geschlossenen Rasen der Wirtsbakterien gezählt werden. Zum Zählen ein Gerät mit indirekter, schräger Beleuchtung verwenden.

   🌡 Temperatur: (36 ± 2) °C

9. Proben mit einer geringen Zahl von Phagen

   Ist die erwartete Zahl von Phagen gering, ist eine vorherige Anreicherung der Probe nötig — die Norm verweist dafür auf ein gesondertes Dokument (ISO 10705-3, in Polen PN-EN ISO 10705-3, von der Verordnung zu diesem Zweck zugelassen). NIZP–PZH reicherte Proben von 100 ml durch Membranfiltration an Filtern aus Celluloseestern an, nach Zugabe von Magnesiumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,05 mol/l.

10. Qualitätssicherung und Ergebnis

    Das Referenzmaterial aus dem Bakteriophagen ΦX174, ATCC 13706-B1, herstellen (Abschnitte 8 und 11.6.1 der Norm). Das Ergebnis als Zahl plaquebildender Teilchen (pfp/pfu) je Volumeneinheit der Probe ausdrücken; für den Vergleich mit dem Bezugswert der Verordnung wird es auf 100 ml Rohwasser umgerechnet.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Der in dieser Norm verwendete Wirtsstamm ist für Menschen und Tiere nicht krankheitserregend — mit ihm nach den üblichen Sicherheitsverfahren eines bakteriologischen Laboratoriums umgehen
• Auch die somatischen Coliphagen sind für Menschen und Tiere nicht krankheitserregend, aber manche Typen sind gegen Austrocknen sehr widerstandsfähig — Kreuzkontaminationen des untersuchten Materials sind zu verhindern
• Die Arbeit mit hochtitrigen Kulturen und das Beimpfen der Wirtsstammkulturen in einer biologischen Sicherheitswerkbank oder in einem abgetrennten Teil des Laboratoriums durchführen
• Chloroform ist ein krebserzeugender Stoff — die gebotenen Vorsichtsmaßnahmen treffen oder ein ebenso wirksames Alternativverfahren anwenden
• Die untersuchten Proben von Oberflächenwasser und Abwasser enthalten Fäkalflora — es gelten die üblichen Regeln für die Arbeit mit potenziell infektiösem Material (Handschuhe, Kittel, Dekontamination der Abfälle)

Häufige Fragen