🍎 Hydroxyprolin (Kollagen) in Fleisch — Hydrolyse in Schwefelsäure, Oxidation mit Chloramin T, Photometrie bei 558 nm
Kurz gefasst
Etwa 4 g der Probe werden 16 h bei 105 °C in Schwefelsäure 3 mol/l hydrolysiert; nach dem Filtrieren und Verdünnen wird das Hydroxyprolin mit Chloramin T oxidiert, bei 60 °C mit p-Dimethylaminobenzaldehyd gekuppelt und die Extinktion des roten Farbstoffs bei 558 nm gegen eine Kalibrierkurve gemessen. Die Prüfung erfolgt nach PN-ISO 3496:2000; Anwendungsbereich: Fleisch und Erzeugnisse mit einem Hydroxyprolingehalt < 0,5 % (m/m). Das Verfahren umfasst 10 Schritte (insgesamt rund 17 Std. 10 Min.); eingesetzt wird sie unter anderem für: Bestimmung des Gehalts an Kollagen (Bindegewebe) in Fleisch und Fleischerzeugnissen, auch in solchen aus Geflügel, Beurteilung der Qualität des Fleischrohstoffs und der Erzeugnisse (das Verhältnis von Kollagen zu Eiweiß), Untersuchungen der Zartheit und der Löslichkeit des intramuskulären Kollagens (Gesamtkollagen = Hydroxyprolin × 7,25).
Auf einen Blick
- Norm: PN-ISO 3496:2000
- Kategorie: Lebensmittelchemie
- Verfahrensschritte: 10
- Gesamtdauer der Schritte: 17 Std. 10 Min.
- Anwendungsbereich: Fleisch und Erzeugnisse mit einem Hydroxyprolingehalt < 0,5 % (m/m)
- Hydrolyse: 30 ± 1 ml H2SO4 3 mol/l, 16 h bei 105 °C
- Farbreaktion: Chloramin T 20 ± 1 min bei Raumtemperatur; das Farbreagenz 20 min bei 60 °C ± 0,5 °C
Übersicht
Die Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung des Hydroxyprolingehalts in allen Arten von Fleisch und Fleischerzeugnissen einschließlich Geflügel mit einem Hydroxyprolingehalt unter 0,5 % (m/m) fest. Hydroxyprolin ist eine für Kollagen kennzeichnende Aminosäure, deshalb dient ihr Gehalt der Berechnung des Gehalts an Bindegewebe: in Untersuchungen von Rindfleischmuskeln wird das bestimmte Hydroxyprolin mit dem Faktor 7,25 in Gesamtkollagen umgerechnet. Die Beschreibung stützt sich auf die Vorschau der ISO 3496:1994, die durch PN-ISO 3496:2000 übernommen wird.
Das Verfahren besteht aus der Hydrolyse der Einwaage in Schwefelsäure bei 105 °C, dem Filtrieren und Verdünnen des Hydrolysats, der Oxidation des Hydroxyprolins mit Chloramin T und der Bildung einer roten Verbindung mit p-Dimethylaminobenzaldehyd, deren Extinktion bei 558 nm gemessen wird. Die Konzentration wird aus einer für jede Analysenserie aus vier Hydroxyprolin-Standardlösungen (0,5; 1; 1,5 und 2 µg/ml) erstellten Kalibrierkurve abgelesen.
Der Kollagengehalt ist für die Zartheit des Fleisches und die Qualität der Erzeugnisse von Bedeutung: in Rindfleischmuskeln schwankte der Gehalt an Gesamtkollagen von 0,4 % (longissimus dorsi) bis 1,3 % (infraspinatus), und Hydroxyprolin steht im Verzeichnis der Bestimmungen des QAFP-Branchenheftes für Konserven.
Prinzip der Methode
Etwa 4 g der Probe (auf 0,001 g genau gewogen) werden mit 30 ± 1 ml Schwefelsäure 3 mol/l im Trockenschrank bei 105 °C 16 h lang hydrolysiert (zweckmäßig über Nacht). Das heiße Hydrolysat wird in einen 250-ml-Messkolben filtriert, dreimal mit 10 ml heißer Säure gewaschen und mit Wasser aufgefüllt. Eine Teilmenge V des Hydrolysats wird auf 250 ml verdünnt, sodass die Hydroxyprolinkonzentration im Bereich 0,5–2 µg/ml liegt (gewöhnlich V = 5–25 ml je nach der Menge des Bindegewebes). Zu 4,00 ml der verdünnten Lösung werden 2,00 ml des Chloramin-T-Reagenzes gegeben (20 min bei Raumtemperatur), danach 2,00 ml des Farbreagenzes mit p-Dimethylaminobenzaldehyd, es wird genau 20 min in einem Bad bei 60 °C erwärmt, abgekühlt und nach 30 min die Extinktion bei 558 ± 2 nm in einer 10-mm-Küvette gegen Wasser gemessen. Der Hydroxyprolingehalt: wh = 6,25·c/(m·V) [Massenprozent], wobei c die Konzentration aus der Kalibrierkurve (µg/ml), m die Masse der Einwaage (g) und V das Volumen der Teilmenge des Hydrolysats (ml) ist. Das Ergebnis wird auf 0,01 % genau angegeben.
Anwendungen
- Bestimmung des Gehalts an Kollagen (Bindegewebe) in Fleisch und Fleischerzeugnissen, auch in solchen aus Geflügel
- Beurteilung der Qualität des Fleischrohstoffs und der Erzeugnisse (das Verhältnis von Kollagen zu Eiweiß)
- Untersuchungen der Zartheit und der Löslichkeit des intramuskulären Kollagens (Gesamtkollagen = Hydroxyprolin × 7,25)
- Kontrolle von Fleischkonserven — die Bestimmung steht im Verzeichnis der Verfahren des QAFP-Systems
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Anwendungsbereich | Fleisch und Erzeugnisse mit einem Hydroxyprolingehalt < 0,5 % (m/m) |
| Hydrolyse | 30 ± 1 ml H2SO4 3 mol/l, 16 h bei 105 °C |
| Farbreaktion | Chloramin T 20 ± 1 min bei Raumtemperatur; das Farbreagenz 20 min bei 60 °C ± 0,5 °C |
| Messung | 558 ± 2 nm, Glasküvette 10 mm, gegen Wasser; die Blindprobe soll eine Extinktion von 0,040 nicht überschreiten |
| Kalibrierkurve | Vier Lösungen von 0,5; 1; 1,5 und 2 µg/ml Hydroxyprolin, für jede Serie eine neue |
| Präzision | r = 0,0131 + 0,0322·wh; R = 0,0195 + 0,0529·wh (wh — der Mittelwert, Massenprozent) |
Norm
- Normnummer
- PN-ISO 3496:2000
- Titel (PL)
- Mięso i przetwory mięsne — Oznaczanie zawartości hydroksyproliny
- Title (EN)
- Meat and meat products — Determination of hydroxyproline content
Schritt-für-Schritt-Verfahren
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Vorbereitung der Probe
Rohes Fleisch kalt in Würfel von etwa 8 mm Kantenlänge schneiden, luftdicht verschließen oder vakuumverpacken und so erwärmen, dass mindestens 70 °C für mindestens 30 min gehalten werden (das macht das Bindegewebe weich); abkühlen und im Fleischwolf homogenisieren. Gekochte Erzeugnisse unmittelbar homogenisieren. Innerhalb von 24 h analysieren und dabei auf eine gleichmäßige Verteilung von Fett und Flüssigkeit achten.
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Einwaage
Etwa 4 g der Probe auf 0,001 g genau in einen Hydrolysekolben einwägen; sich vergewissern, dass das Material nicht an den Wänden haftet.
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Hydrolyse
30 ± 1 ml Schwefelsäure 3 mol/l zugeben, mit einem Uhrglas abdecken und für 16 h in den Trockenschrank bei 105 °C stellen (zweckmäßig über Nacht).
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Filtrieren und Verdünnen des Hydrolysats
Das heiße Hydrolysat in einen 250-ml-Messkolben filtrieren; den Kolben und das Filter dreimal mit Portionen von 10 ml heißer Schwefelsäure 3 mol/l waschen, die Waschflüssigkeit zugeben, mit Wasser bis zur Marke auffüllen und mischen.
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Arbeitsverdünnung
Mit einer Pipette ein Volumen V des Hydrolysats in einen 250-ml-Kolben überführen, so gewählt, dass die Hydroxyprolinkonzentration nach der Verdünnung 0,5–2 µg/ml beträgt (meistens V = 5–25 ml, je nach der Menge des Bindegewebes); mit Wasser auffüllen.
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Oxidation mit Chloramin T
4,00 ml der verdünnten Lösung in ein Reagenzglas überführen, 2,00 ml des Chloramin-T-Reagenzes zugeben, mischen und 20 ± 1 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
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Farbreaktion
2,00 ml des Farbreagenzes zugeben, sorgfältig mischen, das Reagenzglas mit Aluminium- oder Kunststofffolie verschließen und sofort für genau 20 min in ein Wasserbad bei 60 °C stellen.
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Abkühlen und Messung
Das Reagenzglas mindestens 3 min unter fließendem Wasser abkühlen, 30 min bei Raumtemperatur stehen lassen und die Extinktion bei 558 ± 2 nm in einer 10-mm-Glasküvette gegen Wasser messen. Die Extinktion der Blindprobe (einer doppelten, mit Wasser anstelle des Hydrolysats) abziehen.
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Kalibrierkurve
Die Handlungen 6–8 mit je 4,00 ml der vier Standardlösungen ausführen; die Extinktion (nach Abzug der Blindprobe) gegen die Konzentration auftragen und die bestangepasste Gerade durch die Punkte und den Nullpunkt legen. Für jede Analysenserie eine neue Kurve ansetzen.
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Berechnung
wh = 6,25·c/(m·V), wobei c die Hydroxyprolinkonzentration im verdünnten Hydrolysat (µg/ml), m die Masse der Einwaage (g) und V das Volumen der Teilmenge des Hydrolysats (ml) ist. Das Ergebnis auf 0,01 % angeben; beide Ergebnisse verwerfen und die Bestimmung wiederholen, wenn die Differenz r = 0,0131 + 0,0322·wh überschreitet.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Elektrischer Fleischwolf | Mit waagerechten Messern, schnelllaufend | — |
| Hydrolysekolben | Rund- oder flachbödig, weithalsig, etwa 200 ml, mit Uhrgläsern von 5–6 cm abgedeckt | — |
| Trockenschrank | Auf 105 ± 1 °C geregelt | — |
| Wasserbad | Das 60 ± 0,5 °C hält | — |
| Spektrometer oder photoelektrisches Kolorimeter | Für die Messung bei 558 ± 2 nm; Glasküvetten mit einem optischen Weg von 10 mm | — |
| Analysenwaage, pH-Meter, 250-ml-Messkolben, Filter | Wägegenauigkeit 0,001 g; Papierfilter mit einem Durchmesser von 12,5 cm | — |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Schwefelsäure, Lösung 3 mol/l | 7664-93-9 | 320 ml der konzentrierten Säure (Dichte 1,84 g/ml) zu 750 ml Wasser in einem 2-l-Kolben geben, abkühlen und bis zur Marke auffüllen |
| Puffer pH 6,8 | — | 26,0 g Citronensäure-Monohydrat, 14,0 g Natriumhydroxid und 78,0 g wasserfreies Natriumacetat in 500 ml Wasser lösen, 250 ml Propan-1-ol zugeben und auf 1 l auffüllen; bei 4 °C im Dunkeln mehrere Wochen haltbar |
| Chloramin T (das Natriumsalz des N-Chlor-p-toluolsulfonamids, Trihydrat) | 127-65-1 | 1,41 g in 100 ml des Puffers lösen; unmittelbar vor Gebrauch ansetzen |
| p-Dimethylaminobenzaldehyd | 100-10-7 | Das Farbreagenz: 10,0 g in 35 ml Perchlorsäure 60 % (m/m) lösen und langsam 65 ml Propan-2-ol zugeben; am Tag des Gebrauchs ansetzen; nötigenfalls durch Kristallisation aus 70-prozentigem Ethanol reinigen |
| Perchlorsäure 60 % (m/m) | 7601-90-3 | Ein Bestandteil des Farbreagenzes |
| Hydroxyprolin (trans-4-Hydroxy-L-pyrrolidin-2-carbonsäure) | 51-35-4 | Stammlösung: 50 mg in 100 ml Wasser mit einem Tropfen Schwefelsäure (bei 4 °C mindestens 1 Monat haltbar); am Tag des Gebrauchs 5 ml auf 500 ml verdünnen und davon 10, 20, 30 und 40 ml auf 100 ml — die Standards von 0,5; 1; 1,5 und 2 µg/ml |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Schwefelsäure 3 mol/l und die konzentrierte Säure (das Ansetzen der Lösung) — Schutzbrille, Handschuhe, Kittel; die Säure in das Wasser geben, das heiße Hydrolysat vorsichtig filtrieren
- Die Perchlorsäure 60 % im Farbreagenz ist ein starkes Oxidationsmittel — außerhalb des Verfahrens keinen Kontakt mit organischen Materialien zulassen, unter dem Abzug arbeiten
- p-Dimethylaminobenzaldehyd und Chloramin T — das Einatmen des Staubes und den Kontakt mit der Haut vermeiden
- Ein Trockenschrank bei 105 °C über 16 h — die Kolben mit Uhrgläsern abgedeckt, mit Thermohandschuhen herausnehmen
Häufige Fragen
Welche Norm beschreibt diese Prüfung?
Die Prüfung erfolgt nach PN-ISO 3496:2000 — „Meat and meat products — Determination of hydroxyproline content“.
Wie funktioniert diese Methode?
Etwa 4 g der Probe (auf 0,001 g genau gewogen) werden mit 30 ± 1 ml Schwefelsäure 3 mol/l im Trockenschrank bei 105 °C 16 h lang hydrolysiert (zweckmäßig über Nacht). Das heiße Hydrolysat wird in einen 250-ml-Messkolben filtriert, dreimal mit 10 ml heißer Säure gewaschen und mit Wasser aufgefüllt.
Wie groß sind Messbereich und Genauigkeit?
Anwendungsbereich: Fleisch und Erzeugnisse mit einem Hydroxyprolingehalt < 0,5 % (m/m); Hydrolyse: 30 ± 1 ml H2SO4 3 mol/l, 16 h bei 105 °C; Farbreaktion: Chloramin T 20 ± 1 min bei Raumtemperatur; das Farbreagenz 20 min bei 60 °C ± 0,5 °C; Messung: 558 ± 2 nm, Glasküvette 10 mm, gegen Wasser; die Blindprobe soll eine Extinktion von 0,040 nicht überschreiten.
Wie lange dauert die Prüfung?
Die für die einzelnen Schritte angegebenen Zeiten ergeben zusammen rund 17 Std. 10 Min. Das Verfahren umfasst 10 Schritte.
Welche Geräte werden benötigt?
Elektrischer Fleischwolf, Hydrolysekolben, Trockenschrank, Wasserbad, Spektrometer oder photoelektrisches Kolorimeter, Analysenwaage, pH-Meter, 250-ml-Messkolben, Filter.
Wo wird diese Prüfung eingesetzt?
Bestimmung des Gehalts an Kollagen (Bindegewebe) in Fleisch und Fleischerzeugnissen, auch in solchen aus Geflügel; Beurteilung der Qualität des Fleischrohstoffs und der Erzeugnisse (das Verhältnis von Kollagen zu Eiweiß); Untersuchungen der Zartheit und der Löslichkeit des intramuskulären Kollagens (Gesamtkollagen = Hydroxyprolin × 7,25); Kontrolle von Fleischkonserven — die Bestimmung steht im Verzeichnis der Verfahren des QAFP-Systems.
Welche Sicherheitsmaßnahmen gelten?
Schwefelsäure 3 mol/l und die konzentrierte Säure (das Ansetzen der Lösung) — Schutzbrille, Handschuhe, Kittel; die Säure in das Wasser geben, das heiße Hydrolysat vorsichtig filtrieren; Die Perchlorsäure 60 % im Farbreagenz ist ein starkes Oxidationsmittel — außerhalb des Verfahrens keinen Kontakt mit organischen Materialien zulassen, unter dem Abzug arbeiten; p-Dimethylaminobenzaldehyd und Chloramin T — das Einatmen des Staubes und den Kontakt mit der Haut vermeiden; Ein Trockenschrank bei 105 °C über 16 h — die Kolben mit Uhrgläsern abgedeckt, mit Thermohandschuhen herausnehmen.
Welches Labor führt diese Prüfung durch?
Die Prüfung führen nach ISO/IEC 17025 akkreditierte Labore durch. Auf LabCoda finden Sie sie über die Normnummer PN-ISO 3496.