🐟 Histamin in Fisch (HPLC)
Kurz gefasst
Bestimmung von Histamin in Fisch und Fischereierzeugnissen durch HPLC mit Dansylchlorid-Derivatisierung und UV-Detektion. Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 19343:2017; Kalibrierungsbereich: 10–500 mg/kg. Das Verfahren umfasst 12 Schritte (insgesamt rund 3 Std. 27 Min.); eingesetzt wird sie unter anderem für: Obligatorische Histaminkontrolle in Scombridae-Fischen (EG-Verordnung 2073/2005), Prüfung von Thunfisch, Makrele, Bonito, Sardelle, Hering, Sardine, Fischkonserven- und Produktkontrolle (Pasten, Fischsaucen).
Auf einen Blick
- Norm: PN-EN ISO 19343:2017
- Kategorie: Lebensmittelchemie
- Verfahrensschritte: 12
- Gesamtdauer der Schritte: 3 Std. 27 Min.
- Analyt: Histamin (2-[4-Imidazolyl]ethylamin)
- LOQ: 5–10 mg/kg
- Kalibrierungsbereich: 10–500 mg/kg
Übersicht
Histamin ist ein biogenes Amin, das durch Decarboxylierung von Histidin durch bakterielle Enzyme (Histidin-Decarboxylase) in Fisch und Fischereierzeugnissen bei unsachgemäßer Lagerung (zu hohe Temperatur) entsteht. Histaminvergiftung (Scombroid Fish Poisoning) äußert sich durch Kopfschmerzen, Nesselsucht, Übelkeit und Durchfall, und in schweren Fällen — Atembeschwerden und Blutdruckabfall.
EU-Vorschriften (EG-Verordnung 2073/2005) verlangen die Histamin-Prüfung in Fischen aus Familien mit hohem Histidingehalt (Scombridae — Thunfisch, Makrele, Bonito; Clupeidae — Hering, Sardine; Engraulidae — Sardelle). Grenzwerte: 9 Probeneinheiten, mit m = 100 mg/kg (max Durchschnitt) und M = 200 mg/kg (keine Probe darf überschreiten). Für in Lake gereifte Fische (Fischsaucen, Anchovis): m = 200, M = 400 mg/kg.
Die ISO 19343-Methode basiert auf Histamin-Extraktion mit Perchlorsäure, Derivatisierung mit Dansylchlorid (5-(Dimethylamino)naphthalen-1-sulfonylchlorid), Trennung auf HPLC C18-Säule in Umkehrphasensystem und UV-Detektion bei 254 nm. Dansyl-Derivatisierung ist notwendig, da Histamin keinen starken Chromophor für direkte UV-Detektion hat. Alternativ werden OPA (o-Phthalaldehyd) Derivatisierung mit Fluoreszenzdetektion oder direkte LC-MS/MS verwendet.
Histamin ist thermostabil — es wird beim Kochen, Braten oder Konservieren nicht abgebaut. Daher ist die einzige Präventionsmöglichkeit die Aufrechterhaltung der Kühlkette vom Fang bis zum Verbraucher. Die Histamin-Prüfung ist ein Schlüsselelement des HACCP-Systems in der Fischverarbeitung.
Prinzip der Methode
Fischprobe (10 g) wird mit 0,4 mol/L Perchlorsäure durch Homogenisierung und Zentrifugation extrahiert. Überstand wird gereinigt und Vor-Säulen-Derivatisierung mit Dansylchlorid (Dansyl-Cl) in alkalischem Milieu (pH 9–10, Carbonatpuffer) unterzogen. Dansyl-Cl reagiert mit Histamin-Aminogruppen unter Bildung eines fluoreszierenden/UV-absorbierenden Dansyl-Histamin-Derivats. Überschüssiges Dansyl-Cl wird durch Reaktion mit Prolin entfernt. Biogene Amin-Derivate werden auf C18 HPLC-Säule im Acetonitril/Wasser-Gradienten getrennt und UV (254 nm) detektiert. Histaminkonzentration wird aus Kalibrierkurve unter Verwendung des internen Standards (1,7-Diaminoheptan) berechnet.
Anwendungen
- Obligatorische Histaminkontrolle in Scombridae-Fischen (EG-Verordnung 2073/2005)
- Prüfung von Thunfisch, Makrele, Bonito, Sardelle, Hering, Sardine
- Fischkonserven- und Produktkontrolle (Pasten, Fischsaucen)
- Überwachung von Anchovis und in Lake gereiften Fischen
- HACCP-System in der Fischverarbeitung
- Fisch-Kühlketten-Kontrolle (Frische-Indikator)
- Lebensmittelprüfung im Rahmen des RASFF-Programms (Rapid Alert)
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Analyt | Histamin (2-[4-Imidazolyl]ethylamin) |
| LOQ | 5–10 mg/kg |
| Kalibrierungsbereich | 10–500 mg/kg |
| EU-Grenzwert (m) | 100 mg/kg (Frischfisch), 200 mg/kg (Fischsaucen) |
| EU-Grenzwert (M) | 200 mg/kg (Frischfisch), 400 mg/kg (Fischsaucen) |
| Derivatisierung | Dansylchlorid (Vor-Säule) oder OPA (Nach-Säule) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 19343:2017
- Titel (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe histaminy w rybach i przetworach rybnych — Metoda HPLC
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Detection and quantification of histamine in fish and fishery products — HPLC method
Schritt-für-Schritt-Verfahren
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Probenvorbereitung
Fischprobe homogenisieren. 10 g in 50 mL Zentrifugenröhrchen einwiegen.
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Extraktion
20 mL 0,4 mol/L Perchlorsäure zugeben. 2 min homogenisieren (Ultra-Turrax). 10 min bei 3000 rcf zentrifugieren.
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Derivatisierungsvorbereitung
1 mL Überstand in Schraubröhrchen überführen. 200 µL interne Standardlösung (1,7-Diaminoheptan) zugeben.
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Alkalisierung
300 µL gesättigtes NaHCO₃ und 200 µL 2 mol/L NaOH zugeben. Mischen.
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Dansyl-Cl-Derivatisierung
2 mL Dansylchlorid (10 mg/mL in Aceton) zugeben. Auf Vortex mischen. 45 min bei 40°C inkubieren.
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Überschüssiges Dansyl-Cl entfernen
100 µL L-Prolin-Lösung (100 mg/mL) zugeben. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
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Derivat-Extraktion
2 mL Toluol oder Ethylacetat zugeben. 1 min schütteln. Organische Phase entnehmen. Unter N₂ zur Trockne eindampfen.
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Probenrekonstitution
Trockenen Rückstand in 200 µL Acetonitril/Wasser (60:40) lösen. Auf Vortex mischen. In HPLC-Vial filtrieren.
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HPLC-Analyse
20 µL auf C18-Säule injizieren. Gradient: 50→95% MeCN in 25 min. UV-Detektion 254 nm. Durchfluss 1 mL/min.
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Quantifizierung
Histamin/IS-Peakflächenverhältnis berechnen. Konzentration aus Kalibrierkurve ablesen. Verdünnung berücksichtigen.
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Ergebnisinterpretation
Mit EU-Grenzwerten vergleichen: n=9, c=2, m=100 mg/kg, M=200 mg/kg (Frischfisch). Keine Probe darf M überschreiten.
-
Qualitätskontrolle
Jede Serie: Blindprobe, Spike (50 und 200 mg/kg), CRM (FAPAS). Wiederfindung 80–110%, RSD < 15%. PT-Teilnahme.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| HPLC-System mit UV/DAD-Detektor | Shimadzu Nexera + SPD-M40, Agilent 1260 + DAD, Waters Alliance + PDA | 120 000–300 000 PLN |
| HPLC C18-Säule | Waters Symmetry C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm), Phenomenex Luna C18 | 1 500–3 000 PLN |
| Homogenisator | IKA Ultra-Turrax T25, Kinematica Polytron PT 2500E | 5 000–15 000 PLN |
| Laborzentrifuge | Hettich Rotina 380 R, Eppendorf 5810 R (≥3000 rcf) | 15 000–40 000 PLN |
| Wasserbad 40°C | Memmert WNB 7, Julabo TW 12 | 3 000–8 000 PLN |
| Abzug / Digestorium | Für Arbeit mit Dansylchlorid und Perchlorsäure | 15 000–40 000 PLN |
| Analysenwaage 0,1 mg | Mettler Toledo ME204, Radwag AS 220.R2 | 8 000–20 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Histamin-Dihydrochlorid (Standard) | 56-92-8 | Kalibrierstandard, zertifiziertes CRM, 1 g |
| Dansylchlorid (Dansyl-Cl) | 605-65-2 | Derivatisierungsreagenz, 5-(Dimethylamino)naphthalen-1-sulfonylchlorid, 1 g |
| Perchlorsäure 0,4 mol/L | 7601-90-3 | Histamin-Extraktion aus Probe, 500 mL |
| 1,7-Diaminoheptan (interner Standard) | 646-19-5 | Interner Standard IS, 5 g |
| Carbonatpuffer pH 9–10 | — | Derivatisierungsreaktionsumgebung (NaHCO₃/Na₂CO₃) |
| L-Prolin | 147-85-3 | Entfernung von überschüssigem Dansylchlorid nach Derivatisierung, 25 g |
| Acetonitril HPLC Grade | 75-05-8 | Mobile Phase und Lösungsmittel, 2,5 L |
| HPLC Grade Wasser (ultrapure) | — | Mobile Phase, Milli-Q-System (18,2 MΩ·cm) |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Perchlorsäure — starkes Oxidationsmittel (H271, H314). Explosionsgefahr bei Kontakt mit organischen Materialien. Handschuhe und Schutzbrille verwenden.
- Dansylchlorid — reizend (H315, H319). Unter Abzug arbeiten. Dämpfe nicht einatmen.
- Acetonitril — entzündlich und giftig. Unter Abzug arbeiten.
- Toluol — entzündlich und giftig (H225, H304, H315, H336, H361d, H373). Unter Abzug arbeiten.
- Fischproben — können Pathogene enthalten. Handschuhe verwenden. Als biologischer Abfall entsorgen.
Häufige Fragen
Welche Norm beschreibt diese Prüfung?
Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 19343:2017 — „Microbiology of the food chain — Detection and quantification of histamine in fish and fishery products — HPLC method“.
Wie funktioniert diese Methode?
Fischprobe (10 g) wird mit 0,4 mol/L Perchlorsäure durch Homogenisierung und Zentrifugation extrahiert. Überstand wird gereinigt und Vor-Säulen-Derivatisierung mit Dansylchlorid (Dansyl-Cl) in alkalischem Milieu (pH 9–10, Carbonatpuffer) unterzogen.
Wie groß sind Messbereich und Genauigkeit?
Analyt: Histamin (2-[4-Imidazolyl]ethylamin); LOQ: 5–10 mg/kg; Kalibrierungsbereich: 10–500 mg/kg; EU-Grenzwert (m): 100 mg/kg (Frischfisch), 200 mg/kg (Fischsaucen).
Wie lange dauert die Prüfung?
Die für die einzelnen Schritte angegebenen Zeiten ergeben zusammen rund 3 Std. 27 Min. Das Verfahren umfasst 12 Schritte.
Welche Geräte werden benötigt?
HPLC-System mit UV/DAD-Detektor, HPLC C18-Säule, Homogenisator, Laborzentrifuge, Wasserbad 40°C, Abzug / Digestorium, Analysenwaage 0,1 mg. Richtpreis für das Kerngerät (HPLC-System mit UV/DAD-Detektor): 120 000–300 000 PLN.
Wo wird diese Prüfung eingesetzt?
Obligatorische Histaminkontrolle in Scombridae-Fischen (EG-Verordnung 2073/2005); Prüfung von Thunfisch, Makrele, Bonito, Sardelle, Hering, Sardine; Fischkonserven- und Produktkontrolle (Pasten, Fischsaucen); Überwachung von Anchovis und in Lake gereiften Fischen; HACCP-System in der Fischverarbeitung; Fisch-Kühlketten-Kontrolle (Frische-Indikator); Lebensmittelprüfung im Rahmen des RASFF-Programms (Rapid Alert).
Welche Sicherheitsmaßnahmen gelten?
Perchlorsäure — starkes Oxidationsmittel (H271, H314). Explosionsgefahr bei Kontakt mit organischen Materialien. Handschuhe und Schutzbrille verwenden.; Dansylchlorid — reizend (H315, H319). Unter Abzug arbeiten. Dämpfe nicht einatmen.; Acetonitril — entzündlich und giftig. Unter Abzug arbeiten.; Toluol — entzündlich und giftig (H225, H304, H315, H336, H361d, H373). Unter Abzug arbeiten.; Fischproben — können Pathogene enthalten. Handschuhe verwenden. Als biologischer Abfall entsorgen.
Welches Labor führt diese Prüfung durch?
Die Prüfung führen nach ISO/IEC 17025 akkreditierte Labore durch. Auf LabCoda finden Sie sie über die Normnummer PN-EN ISO 19343.