🦠 Koagulasepositive Staphylokokken in Lebensmitteln — Nachweis und MPN geringer Zahlen (Giolitti-Cantoni-Bouillon)

Mikrobiologie PN-EN ISO 6888-3

Übersicht

ISO 6888-3:2003 legt ein horizontales Verfahren zur Zahlbestimmung und zum Nachweis koagulasepositiver Staphylokokken nach der Technik der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN) in Erzeugnissen für Menschen und Tiere sowie in Umgebungsproben aus der Herstellung von und dem Verkehr mit Lebensmitteln fest. Empfohlen wird es für Erzeugnisse, in denen die Staphylokokken voraussichtlich geschädigt (gestresst) und wenig zahlreich sind, z. B. in getrockneten Erzeugnissen. Koagulasepositive Staphylokokken sind vor allem Staphylococcus aureus, doch die Koagulase bilden auch S. intermedius und manche Stämme von S. hyicus. Sie werden als Bakterien definiert, die auf der Oberfläche eines selektiven Nährmediums typische und/oder untypische Kolonien bilden und eine positive Koagulasereaktion oder eine spezifische Reaktion mit dem Kaninchenplasma auf dem RPF-Agar zeigen; die Bestätigung beruht auf einer deutlich positiven Koagulasereaktion, und schwach positive Stämme werden mit zusätzlichen Prüfungen unterschieden (z. B. Thermonuklease, IDF 83). In den Skripten der UWM erscheint dieses Verfahren als „Bestimmung der Anwesenheit oder der MPN" der Staphylokokken: Beimpfung der Giolitti-Cantoni-Bouillon in 3 Wiederholungen (doppelt konzentriert bei 10 cm³ Material), 37 °C/24–48 h anaerob, Schwarzfärbung = positives Ergebnis, Bestätigung auf RPF oder auf Baird-Parker. Die Norm wurde mit einer Berichtigung veröffentlicht (Unterabschnitt 9.1.1); in Polen gilt sie als PN-EN ISO 6888-3:2004.

Prinzip der Methode

Nachweis: Das flüssige selektive Nährmedium wird mit einer festgelegten Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung beimpft und anaerob bei 37 °C 24 h und 48 h bebrütet — die Anwesenheit präsumtiver koagulasepositiver Staphylokokken zeigt die Reduktion des Kaliumtellurits an (die Anaerobiose wird mit einem Verschluss aus Agar oder Paraffin in jedem Röhrchen oder durch die Bebrütung im Anaerobiertopf bzw. im Anaerobier-Brutschrank erreicht). Aus den nach 24 h positiven Röhrchen und aus den übrigen nach 48 h wird auf die Oberfläche des Baird-Parker-Agars ausgestrichen und bei 37 °C 24 h und 48 h bebrütet — präsumtive Staphylokokken zeigen die Reduktion des Tellurits und die Reaktion mit dem Eigelb an; die typischen und untypischen Kolonien werden mit der Koagulasereaktion bestätigt. Alternativ wird auf Kaninchenplasma-Fibrinogen-Agar ausgestrichen, auf dem Kolonien mit der spezifischen Reaktion die Bestätigung darstellen. Ergebnis: „nachgewiesen/nicht nachgewiesen" in x g oder x ml. Zahlbestimmung: Die Verdünnungsreihe des Erzeugnisses wird in das flüssige selektive Nährmedium eingeimpft, es wird wie oben vorgegangen, und die MPN je g oder ml wird für die bestätigten Verdünnungen aus Tabellen abgelesen. Modifizierte Giolitti-Cantoni-Bouillon (Basisnährmedium, auf 1000 ml; einfach / doppelt konzentriert): Caseinhydrolysat 10/20 g, Fleischextrakt 5/10 g, Hefeextrakt 5/10 g, Lithiumchlorid 5/10 g, Mannit 20/40 g, NaCl 5/10 g, Glycin 1,2/2,4 g, Natriumpyruvat 3/6 g, Tween 80 1/2 g; dem Nährmedium wird eine Kaliumtelluritlösung zugesetzt (weiterer Teil des Abschnitts 5). Verdünnungsmittel nach ISO 6887, ISO 8261 oder nach der Produktnorm.

Anwendungen

• Getrocknete Erzeugnisse und Erzeugnisse mit niedriger Wasseraktivität (Milchpulver, Gewürze, Konzentrate), in denen die Staphylokokken geschädigt und wenig zahlreich sind
• Nachweis koagulasepositiver Staphylokokken in einer festgelegten Menge des Erzeugnisses (z. B. 1 g, 10 g)
• Bestimmung geringer Zahlen unterhalb der Grenze der Plattenverfahren ISO 6888-1/-2
• Umgebungsproben aus der Herstellung von und dem Verkehr mit Lebensmitteln
• Futtermittel

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 6888-3:2004 (ISO 6888-3:2003)

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków) — Część 3: Wykrywanie obecności i oznaczanie małych liczb metodą NPL

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 3: Detection and MPN technique for low numbers

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probe

   Bereite die Erstverdünnung und die Verdünnungen nach ISO 6887 (entsprechender Teil), ISO 8261 oder nach der Produktnorm vor.

2. Beimpfung der Bouillon

   Nachweis: eine festgelegte Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung in ein Röhrchen mit der selektiven Bouillon (bei 10 ml Material — doppelt konzentriert). Zahlbestimmung: die Verdünnungsreihe in Röhrchen mit der Bouillon (in der Praxis je 3 Röhrchen je Verdünnung).

3. Anaerobe Bebrütung

   Stelle die Anaerobiose sicher (Verschluss aus Agar oder Paraffin oder Anaerobiertopf/Anaerobier-Brutschrank) und bebrüte bei 37 °C; beurteile nach 24 h und 48 h — die Schwarzfärbung (Telluritreduktion) kennzeichnet ein präsumtiv positives Röhrchen.

4. Ausstrich auf das feste Nährmedium

   Streiche aus den nach 24 h positiven Röhrchen und aus allen übrigen nach 48 h im Oberflächenverfahren auf Baird-Parker-Agar aus (37 °C, 24 h und 48 h) — Kolonien mit Telluritreduktion und Reaktion mit dem Eigelb sind präsumtiv; alternativ auf RPFA, wo die spezifische Reaktion mit dem Plasma die Bestätigung darstellt.

5. Bestätigung

   Bestätige die typischen und untypischen Kolonien vom Baird-Parker-Agar mit der Koagulasereaktion (nach UWM: 0,1 cm³ der Bouillonkultur + 0,3 cm³ Kaninchenplasma, 37 °C, Ablesung nach 4–6 h, bei negativem Ergebnis — nach weiteren 24 h); bei schwacher Reaktion — Thermonukleasetest.

6. Ergebnis

   Nachweis: nachgewiesen/nicht nachgewiesen in x g oder ml. Zahlbestimmung: Lies aus der Zahl der bestätigten Röhrchen in den einzelnen Verdünnungen die MPN je g oder ml aus den Tabellen ab.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Koagulasepositive Staphylokokken bilden Enterotoxine — Arbeit in einem entsprechend ausgestatteten Labor unter der Aufsicht eines Mikrobiologen, sorgfältige Entsorgung der Materialien
• Kaliumtellurit ist giftig — Handschuhe, Staubbildung vermeiden; Lithiumchlorid — Kontakt vermeiden
• Anaerobiertöpfe mit Gasgeneratoren — nach der Anleitung des Herstellers; Paraffin — beim Aufbringen der Verschlüsse heiß

Häufige Fragen