🦠 Koagulasepositive Staphylokokken in Lebensmitteln — Plattenzählverfahren auf Kaninchenplasma-Fibrinogen-Agar (RPFA)

Mikrobiologie PN-EN ISO 6888-2

Übersicht

ISO 6888-1, ISO 6888-2 und ISO 6888-3 beschreiben drei horizontale Verfahren zum Nachweis und zur Zahlbestimmung koagulasepositiver Staphylokokken, unter denen enterotoxinbildende Stämme vorkommen — vor allem Staphylococcus aureus, aber auch S. intermedius und manche Stämme von S. hyicus. Die Charakterisierung beruht auf der positiven Koagulasereaktion; Stämme mit schwach positiver Reaktion können mit anderen Bakterien verwechselt werden und lassen sich mit zusätzlichen Prüfungen unterscheiden (Empfindlichkeit gegenüber Lysostaphin, Hämolysin, thermostabile Nuklease, Säure aus Mannit). ISO 6888-2:2021 (zweite Ausgabe, die ISO 6888-2:1999 mit Amd 1:2003 ersetzt) legt ein Verfahren zur Koloniezählung auf Kaninchenplasma-Fibrinogen-Agar nach aerober Bebrütung bei 34–38 °C fest; es wird auf Erzeugnisse für Menschen und Tiere, auf Umgebungsproben aus der Herstellung von Lebensmitteln und Futtermitteln sowie auf Proben aus der Primärproduktion angewendet. Die Änderungen gegenüber der vorherigen Ausgabe sind u. a. das Übergießen mit dem Nährmedium bei 44–47 °C (gemäß ISO 7218), der Temperaturbereich 34–38 °C anstelle von „35 °C oder 37 °C", die Zeit 24 h ± 2 h anstelle von 18–24 h, die Forderung nach der Anwendung der ISO 11133 und nach der Leistungsprüfung des RPFA-Nährmediums; die Änderungen wurden als geringfügig eingestuft. Das Verfahren gilt nicht als vollständig geeignet für fermentierte Erzeugnisse mit einer technologischen Flora von Staphylococcus spp. (z. B. S. xylosus — Käse aus Rohmilch, manche rohe Fleischerzeugnisse), für Erzeugnisse, die mit Staphylokokken verunreinigt sind, welche auf dem Baird-Parker-Agar untypische Kolonien bilden, oder für Erzeugnisse mit einer die Kolonien verdeckenden Flora; ISO 6888-1 und ISO 6888-2 haben gleichwertigen Status. Die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 nennt EN/ISO 6888-2 als Referenzverfahren für das Prozesshygienekriterium bei Käse aus Rohmilch (10⁴–10⁵ KBE/g) sowie „EN/ISO 6888-1 oder 2" für Käse aus pasteurisierter Milch, Frischkäse, Milch- und Molkenpulver, Erzeugnisse aus Weichtieren und Krebstieren (bei > 10⁵ KBE/g Untersuchung auf Enterotoxine).

Prinzip der Methode

Die Platten werden im Plattengussverfahren mit einer festgelegten Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung sowie aus den Zehnerverdünnungen hergestellt (Zahl der Platten nach ISO 7218); das zum Inokulum zugegebene Volumen des RPFA-Nährmediums ist ein kritischer Punkt für die Koagulasereaktion — in jede Platte werden sofort 18–20 ml des frisch hergestellten vollständigen Nährmediums (B.2.3) gegossen, um eine Schicht von mindestens 3 mm zu erhalten. Die Platten werden aerob bei 34–38 °C bebrütet (Brutschränke eingestellt auf 35 °C ± 1 °C, 36 °C ± 2 °C oder 37 °C ± 1 °C) und nach 24 h ± 2 h beurteilt, wobei die Lage der typischen Kolonien auf dem Boden markiert wird; fehlen sie — Nachbebrütung auf insgesamt 48 h ± 4 h. Die typischen Kolonien sind schwarz, grau oder sogar weiß, klein und von einer trüben Präzipitationszone umgeben, die auf die Koagulaseaktivität hinweist; Proteus-Kolonien können anfangs ähnlich aussehen, werden aber nach 24–48 h braun und schwärmen. Da das Nährmedium auf der Koagulasereaktion beruht, ist eine Bestätigung nicht erforderlich; trotz des Trypsininhibitors im RPFA können typische Kolonien nach 24 h ihr typisches Aussehen nach 48 h verlieren (Trypsin, Überwucherung), sodass eine Zählung erst nach 48 h zu niedrige Ergebnisse liefern kann. Für die Zählung werden Platten mit höchstens 300 Kolonien, darunter 100 typischen, zurückbehalten; eine Platte muss mindestens 10 Kolonien aufweisen; bei Zahlen nahe der Bestimmungsgrenze werden Doppelbestimmungen empfohlen (Summe ≥ 10 Kolonien, was > 5 KBE/ml oder > 50 KBE/g entspricht). Das Ergebnis wird nach ISO 7218 als KBE/g, KBE/ml, KBE/cm² oder je Probenahmegerät berechnet; die Zusammensetzung der Nährmedien und die Leistungsprüfungen — Anhang B / ISO 11133; die Präzision aus dem Ringversuch (Käse, Fleisch, Eipulver, Referenzmaterialien) — Anhang C. Nach dem Skript der UWM entsteht die Trübung um die Kolonien durch die Reaktion der Koagulase mit dem Prothrombin des Plasmas — das entstandene Staphylothrombin bildet mit dem Fibrinogen Polymere, die sich um die Kolonien ausfällen.

Anwendungen

• Prozesshygienekriterium für Käse aus Rohmilch (Referenzverfahren EN/ISO 6888-2) und für andere Käse, Milch- und Molkenpulver, Erzeugnisse aus Krebstieren und Weichtieren (6888-1 oder 2) — Verordnung (EG) Nr. 2073/2005
• Fleischerzeugnisse, Feinkosterzeugnisse, Cremegebäck, Speiseeis — Beurteilung der Herstellungshygiene und des Risikos von Staphylokokken-Enterotoxinen
• Umgebungsproben aus der Herstellung von Lebensmitteln und Futtermitteln sowie aus der Primärproduktion
• Alternative zum Baird-Parker-Agar (ISO 6888-1) ohne die Stufe der Koagulasebestätigung im Röhrchen
• Futtermittel und Rohstoffe

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 6888-2:2022-03 (ISO 6888-2:2021)

Titel (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków) — Część 2: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 2: Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probe

   Bereite die Probe, die Erstverdünnung (10⁻¹) und die Verdünnungen nach der Normenreihe ISO 6887 vor (Oberflächen — ISO 18593; Probenahme: ISO/TS 17728 Lebensmittel, ISO 707 Milch, ISO 17604 Schlachtkörper, ISO 13307 Primärproduktion).

2. Plattengussverfahren

   Übertrage mit einer sterilen Pipette 1 ml der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung (und der weiteren Verdünnungen) in Petrischalen in der Zahl nach ISO 7218.

3. Übergießen mit RPFA

   Gieße sofort in jede Platte 18–20 ml des frisch hergestellten vollständigen RPFA-Nährmediums (44–47 °C), um eine Schicht ≥ 3 mm zu erhalten; mische vorsichtig und lass auf einer waagerechten Fläche erstarren.

4. Bebrütung

   Bebrüte die umgedrehten Platten bei 34–38 °C 24 h ± 2 h; markiere die typischen Kolonien auf dem Boden. Fehlen Kolonien oder typische Kolonien — bebrüte weitere 24 h ± 2 h nach (insgesamt 48 h ± 4 h) und markiere die neuen typischen Kolonien.

5. Zählung

   Zähle die typischen Kolonien (schwarz, grau oder weiß, klein, mit trüber Präzipitationszone); unterscheide Proteus (Braunfärbung, Schwärmen). Behalte Platten mit ≤ 300 Kolonien zurück, darunter ≤ 100 typischen, wobei eine Platte ≥ 10 Kolonien aufweisen muss; verwende bei geringen Zahlen Doppelbestimmungen (Summe ≥ 10).

6. Ergebnis

   Berechne nach ISO 7218 die Zahl der koagulasepositiven Staphylokokken in KBE/g, ml, cm² oder je Probenahmegerät; ohne Kolonien — Ergebnis nach ISO 7218 für die besonderen Fälle; vergleiche mit den Kriterien der 2073/2005.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Koagulasepositive Staphylokokken können Enterotoxine bilden — Untersuchungen in einem entsprechend ausgestatteten Labor unter der Aufsicht eines Mikrobiologen, sorgfältige Entsorgung der Materialien nach der Bebrütung
• Kaninchenplasma und Fibrinogen — Materialien tierischen Ursprungs, durch Filtration sterilisiert, im Kühlschrank aufbewahrt
• Heißer Agar 44–47 °C — Schutz vor Verbrennungen

Häufige Fragen