🦠 Koagulase-positive Staphylokokken (S. aureus)

Mikrobiologie PN-EN ISO 6888-1

Übersicht

Staphylococcus aureus ist eine der häufigsten bakteriellen Ursachen für Lebensmittelvergiftungen weltweit. Koagulase-positive Staphylokokken produzieren thermostabile Enterotoxine (SE A–E), die selbst während der Wärmebehandlung von Lebensmitteln nicht zerstört werden. Nur etwa 100 ng Enterotoxin reichen aus, um beim Menschen Vergiftungssymptome hervorzurufen. Die Quelle der Lebensmittelkontamination ist meist das Produktionspersonal (Nasenträger, infizierte Wunden an den Händen).

Die Norm PN-EN ISO 6888-1 beschreibt ein horizontales Verfahren zur Bestimmung von koagulase-positiven Staphylokokken mit selektivem Baird-Parker-Medium. Das Medium enthält Kaliumtellurit und Lithiumchlorid als hemmende Wirkstoffe für Begleitbakterien, während Glycin und Natriumpyruvat das Staphylokokken-Wachstum stimulieren. S. aureus-Kolonien auf diesem Medium sind schwarz oder grau, glänzend und konvex, umgeben von einer Aufhellungszone (Reduktion von Tellurit zu metallischem Tellur).

Die Methode wird weltweit als Goldstandard für die Staphylokokken-Bestimmung in Lebensmitteln verwendet. Sie ermöglicht gleichzeitige Bestimmung und vorläufige Identifizierung basierend auf Koloniemorphologie. Die Bestätigung erfolgt durch Koagulase-Röhrchentest oder RPFA-Methode (Rabbit Plasma Fibrinogen Agar).

Die Untersuchung ist gemäß Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 für Käse, Milchpulver, verzehrfertige Produkte und Säuglingsnahrung obligatorisch. Sie ist ein Schlüsselelement von HACCP-Systemen in Molkereien, Konditoreien und Gastronomiebetrieben.

Prinzip der Methode

Die Methode beinhaltet Oberflächenaussaat der Probe auf selektivem Baird-Parker-Medium, angereichert mit Eigelb-Emulsion und Kaliumtellurit. Kaliumtellurit (K₂TeO₃) wird von Staphylokokken zu metallischem Tellur reduziert, was den Kolonien charakteristische schwarze Färbung verleiht. Lithiumchlorid und Tellurit hemmen das Wachstum der meisten Begleitbakterien. Von S. aureus produzierte Lecithinase verursacht Opalisierung (Aufhellungszone) um Kolonien. Lipase baut Eigelbfette ab und bildet einen äußeren Präzipitationsring. Nach 24–48 h Inkubation bei 34–38°C werden typische Kolonien durch Koagulase-Test bestätigt.

Anwendungen

• Qualitätskontrolle von Käse und Milchprodukten
• Untersuchung von verzehrfertigen Lebensmitteln (RTE) — Kriterien der Verordnung (EG) 2073/2005
• Überwachung der Produktionshygiene in Konditoreien und Gastronomiebetrieben
• Kontrolle von Säuglings- und Kleinkindernahrung
• Untersuchung von Fleisch und Fleischerzeugnissen
• Untersuchung von Handabstrichen des Personals und Oberflächenabstrichen (GHP)
• Lebensmittelanalyse im Rahmen epidemiologischer Untersuchungen (Lebensmittelvergiftung)
• Überprüfung der Wirksamkeit thermischer und konservierender Prozesse

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 6888-1:2022

Titel (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i inne gatunki) — Część 1: Metoda z zastosowaniem podłoża agarowego Baird-Parkera

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 1: Method using Baird-Parker agar medium

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenvorbereitung

   Wiegen Sie 10 g (oder 25 g) Probe in einen Stomacher-Beutel. Fügen Sie 90 mL (oder 225 mL) gepuffertes Peptonwasser hinzu. Homogenisieren Sie für 60–120 s.

   ⏱ Zeit: 5 min

2. Herstellung der Verdünnungen

   Bereiten Sie eine Dezimalverdünnungsreihe (10⁻², 10⁻³) vor. Verwenden Sie für jede Verdünnung eine neue Pipette.

   ⏱ Zeit: 5 min

3. Medienvorbereitung

   Lösen Sie Baird-Parker Agar Base in destilliertem Wasser. Sterilisieren Sie bei 121°C für 15 min. Kühlen Sie auf 47–50°C ab und fügen Sie aseptisch Eigelb-Emulsion mit Tellurit hinzu. Gießen Sie auf Platten (ca. 18–20 mL). Trocknen Sie die Platten.

   ⏱ Zeit: 30 min • 🌡 Temperatur: 47–50°C

4. Oberflächenaussaat

   Bringen Sie je 0,1 mL (insgesamt bis zu 0,3 mL auf 3 Platten aus derselben Verdünnung) auf die Mediumoberfläche auf. Verteilen Sie gleichmäßig über die gesamte Oberfläche mit Drigalski-Spatel.

   ⏱ Zeit: 10 min

5. Trocknung des Inokulums

   Lassen Sie die Platten offen in der Laminar-Flow-Werkbank bis zur Absorption des Inokulums (ca. 15 min).

   ⏱ Zeit: 15 min

6. Inkubation

   Drehen Sie die Platten um und inkubieren Sie bei 34–38°C. Lesen Sie vorläufig nach 24 ± 2 h ab, markieren Sie typische Kolonien und setzen Sie die Inkubation bis 48 ± 4 h fort.

   ⏱ Zeit: 24–48 h • 🌡 Temperatur: 37°C

7. Kolonieablesung

   Zählen Sie typische Kolonien (schwarz/grau, glänzend, konvex, umgeben von Aufhellungszone und/oder Opalisierungsring). Markieren Sie auch atypische Kolonien (schwarz ohne Zonen).

   ⏱ Zeit: 15 min

8. Koagulase-Test (Bestätigung)

   Wählen Sie min. 5 typische und 5 atypische Kolonien. Beimpfen Sie 0,3 mL BHI-Bouillon, inkubieren Sie 24 h bei 37°C. Fügen Sie 0,3 mL Kaninchenplasma hinzu. Inkubieren Sie bei 37°C und beobachten Sie Gerinnselbildung nach 4–6 h (max. 24 h).

   ⏱ Zeit: 24 h • 🌡 Temperatur: 37°C

9. Berechnungen

   Berechnen Sie die Anzahl koagulase-positiver Staphylokokken unter Berücksichtigung des Prozentsatzes bestätigter Kolonien. Ergebnis in KBE/g oder KBE/mL ausdrücken.

10. Qualitätskontrolle

    Positivkontrolle: S. aureus ATCC 25923 (typische Kolonien). Negativkontrolle: E. coli ATCC 25922 (kein Wachstum oder atypische Kolonien). Mediumsterilitätskontrolle.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• S. aureus — BSL-2-Erreger, vollständige persönliche Schutzausrüstung verwenden
• Kaliumtellurit — toxisch, Einatmen und Hautkontakt vermeiden, in Laminar-Flow-Werkbank arbeiten
• Alle Tätigkeiten mit offener Probe in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II durchführen
• Gebrauchte Materialien vor Entsorgung autoklavieren (121°C, 20 min)
• Oberflächendesinfektion mit 70% Ethanol oder 0,5% Natriumhypochlorit

Häufige Fragen