🍎 Qualitativer Nachweis gentechnisch veränderter Organismen (GVO) und daraus hergestellter Produkte in Lebensmitteln (auch in Futtermitteln und Pflanzenproben) mit nukleinsäurebasierten Verfahren — nach ISO 21571 extrahierte DNA wird mittels PCR amplifiziert (Nachweis durch Elektrophorese oder Real-Time-PCR, Bestätigung durch Hybridisierung, Restriktionsverdau oder Sequenzierung) für taxonspezifische, Screening- (z. B. 35S-Promotor), konstrukt- oder eventspezifische Sequenzen; mit Kontrollen und Kriterien aus ISO 24276, Primeroptimierung (18–30 Nukleotide, etwa 60 °C), Amplikon von 60–150 bp bei stark abgebauter DNA; Ergebnis „Zielsequenz nachgewiesen / nicht nachgewiesen“ mit Nachweisgrenze und Referenzmaterial, PN-EN ISO 21569

Lebensmittelchemie PN-EN ISO 21569

Übersicht

WAS DIE NORM BESCHREIBT. Den Normtext lesen wir in der iTeh-Leseprobe der ISO 21569:2005 in der französischen Fassung („Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques“, erste Ausgabe vom 15.06.2005, französische Fassung von 2006): Inhaltsverzeichnis, Vorwort, Einleitung, Abschnitte 1–10 und Anfang von Anhang A bis A.1.5.3 (sojaspezifisches Verfahren) — die Leseprobe endet auf Seite 9. Das europäische Vorwort lesen wir in der Leseprobe der SIST EN ISO 21569:2005 (englischer Text, bis 7.6). Den Rest von Anhang A und die Anhänge B (Screeningverfahren), C (konstruktspezifische Verfahren) und D (eventspezifische Verfahren) lesen wir nicht; die Titel kennen wir aus dem Inhaltsverzeichnis. Die Änderung ISO 21569:2005/Amd 1:2013 lesen wir in einer eigenen iTeh-Leseprobe (französischer Text, „Amendement 1“, 2013-04-01): vom Deckblatt bis A.6.3.3 (Seite 11); den Rest des neuen Abschnitts A.6 lesen wir nicht.

NACH DEM TEXT DER ISO 21569:2005. Die Norm erarbeitete CEN/TC 275 „Lebensmittelanalytik — Horizontale Verfahren“ in Zusammenarbeit mit ISO/TC 34 (Wiener Vereinbarung); nach dem EN-Vorwort mussten nationale Normen sie spätestens im Dezember 2005 übernehmen. Einleitung: die Untersuchung auf GV-Bestandteile besteht aus Probenahme (ISO 21568), Extraktion der Nukleinsäuren (ISO 21571), deren eventueller Reinigung, Quantifizierung, Verdünnung und Analyse (z. B. PCR); quantitative Verfahren — ISO 21570, allgemeine Anforderungen und Begriffe — ISO 24276; der qualitative Nachweis stellt Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielsequenz mit geeigneten Kontrollen fest, innerhalb der Nachweisgrenze des Verfahrens und der analysierten Portion; die Verfahren der Anhänge A–D reichen vom Screening bis zu konstrukt- und eventspezifischen Verfahren; Normkonformität kann eine Lizenz für die PCR-Technologie erfordern. Anwendungsbereich (1): qualitativer Nachweis von GVO und daraus hergestellten Produkten in aus der Probe extrahierten Nukleinsäuren, hauptsächlich durch PCR-Amplifikation; Anforderungen an den spezifischen Nachweis und die Identifizierung von Zielsequenzen und an die Bestätigung der Produktidentität; für Lebensmittelmatrices entwickelt, auf andere anwendbar (z. B. Futtermittel und Pflanzenproben aus der Umwelt). Verweisungen (2): ISO 21571:2005 (Extraktion), ISO 24276 (allgemeine Anforderungen und Begriffe, zum Zeitpunkt der Veröffentlichung in Vorbereitung). Prinzip (4): jedes Verfahren muss die Zielsequenz angeben; ein qualitatives Ergebnis muss die Anwesenheit oder Abwesenheit des genetischen Elements eindeutig angeben, innerhalb der Nachweisgrenze und der Prüfportion; Amplifikation durch DNA-Polymerase mit Primern in Zyklen aus Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung, nach Prüfung auf Abwesenheit von Inhibitoren; Nachweis durch Gelelektrophorese oder eine andere Technik, Bestätigung der Identität z. B. durch Restriktionsenzyme, Hybridisierung oder Sequenzierung; bei der Real-Time-PCR erfolgen Amplifikation und Nachweis gleichzeitig. Reagenzien (5): Lösungen meist bei etwa −20 °C, aliquotiert, um Gefrier-Auftau-Zyklen und Kontamination zu vermeiden; dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP oder dUTP — dUTP kann die Analyse mit Restriktionsenzymen beeinflussen); PCR-Puffer, MgCl2-Konzentration verfahrensspezifisch (in den Anhängen); thermostabile Polymerase; Primer. Durchführung (7): DNA ausreichend rein, mit wiederholbarer und reproduzierbarer Qualität und Menge für Verfahren und Matrix; die Nachweisgrenze hängt von der Verarbeitung des Produkts und dem DNA-Abbau ab; Inhibitionskontrollen stets nach ISO 24276; Bedingungen (MgCl2, Temperaturprofil) werden für jedes Primerpaar optimiert; in einer optimalen Reaktion genügen weniger als 40 Zyklen zur Amplifikation von 10 Zielmolekülen, und eine optimierte PCR soll in 40 Zyklen aus 100 Kopien Matrizen-DNA ein nachweisbares Produkt liefern; Hot-Start-PCR wird empfohlen; Validierungswerte gelten möglicherweise nicht für andere Matrices und Konzentrationen; Produktlänge an die DNA im Extrakt angepasst — bei stark abgebauter DNA aus verarbeiteten Lebensmitteln 60–150 bp, bei Rohstoffen bis etwa 250 bp; Primer von 18–30 Nukleotiden, optimale Anlagerungstemperatur etwa 60 °C, experimentell bestimmt (geschätzte Schmelztemperatur — 65 °C mit im Text der Leseprobe unlesbarem Relationszeichen), GC:AT möglichst 50:50, minimale Komplementarität der 3′-Enden und Sekundärstruktur; theoretische (Datenbanksuche, z. B. EMBL, GenBank) und experimentelle Validierung der Spezifität; Ziele: taxon-, konstrukt-, eventspezifische Sequenzen und Screening-Elemente; Kontrollen obligatorisch (ISO 24276), möglichst zertifizierte Referenzmaterialien als Positiv- und Negativkontrolle; Bestätigung des Ergebnisses mit Primern für eine andere Sequenz (besonders nach einem Screening) oder durch Hybridisierung, Verdau oder Sequenzierung; bei Sequenzen aus natürlich vorkommenden Organismen (Virus, Bakterium) ist zu prüfen, ob die DNA aus einem GVO stammt — z. B. stammt der 35S-Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV), sein Nachweis kann also auf einen GVO oder auf CaMV selbst hinweisen. Auswertung (8): positiv — spezifisches Produkt nachgewiesen und Kontrollen gemäß Tabelle 2 der ISO 24276; negativ — kein Produkt bei konformen Kontrollen; eventspezifische Sequenzen können in einem GVO gemeinsam vorkommen (gestapelte Gene); uneindeutiges Ergebnis — Wiederholung. Angabe der Ergebnisse (9): kein „±“; ein negatives Ergebnis nie als „kein GVO“; Nachweisgrenze bezogen auf mindestens ein Referenzmaterial und einen relativen Wert in der Matrix (z. B. 100 ng DNA GTS 40-3-2 bei 0,01 %); negatives Ergebnis: „Für die Probe X wurde die Zielsequenz Y nicht nachgewiesen. Die LOD des Verfahrens beträgt x %, bestimmt an ABC“, und wenn nicht gezeigt werden kann, dass die Menge der Ziel-DNA zum Erreichen der LOD genügt — ein Zusatz, dass die DNA-Menge der Art unzureichend gewesen sein kann; positives Ergebnis: „Für die Probe X wurde die Zielsequenz Y nachgewiesen“, gegebenenfalls mit der Identität des GVO; Ergebnisse zweier Prüfportionen müssen übereinstimmen — bei Abweichung Wiederholung, möglichst mit mehr DNA, mit Inhibitionskontrolle. Prüfbericht (10): nach ISO 24276, mindestens LOD mit Matrix, Beschreibung der Spezifität und Ergebnisse nach Abschnitt 9. Anhang A.1 (Soja, Lektingen Le1, Amplikon 118 bp, Agarosegelelektrophorese): Verfahren validiert in Ringversuchen des BgVV von 1997 (25 Laboratorien, 220 akzeptierte Ergebnisse, 0 falsch positive und negative) und 1998/1999 (27 Laboratorien, 60 Ergebnisse, je 1 falsch positives und negatives — 2 %), mit CTAB-Extraktion nach ISO 21571:2005, A.3 (Portion 100 mg); keine Amplifikation der DNA anderer Kulturpflanzen, von Rind- und Schweinefleisch; absolute LOD nicht bestimmt, weist mindestens 0,1 ng Soja-DNA nach.

NACH DER ÄNDERUNG ISO 21569:2005/AMD 1:2013. Die Änderung erarbeitete ISO/TC 34 „Lebensmittel“, Unterkomitee SC 16 „Horizontale Verfahren für die Analyse molekularer Biomarker“. Einleitung: die Probenahme (ISO 21568) wird aus der Liste der Schritte gestrichen. Die Verweisung auf ISO 24276 erhält das Datum 2006 (auch in 8.1). 4.1, Absatz 1 — neue Fassung: ein qualitatives Ergebnis muss die Anwesenheit oder Abwesenheit des untersuchten genetischen Elements eindeutig angeben, geprüft mit geeigneten Kontrollen; Anmerkung: Nachweisgrenze und Größe der Prüfportion sind kritische Merkmale eines Verfahrens. 7.3.3.3.3: Primer für taxonspezifische Sequenzen müssen diese Sequenzen in einer „geeigneten“ (statt „repräsentativen“) Zahl verschiedener Vertreter des Taxons zuverlässig nachweisen. 9.4 — neue Fassung: Ergebnisse aus derselben Prüfportion müssen übereinstimmen — bei +/− in den zwei Wiederholungen werden beide PCR wiederholt, und ergeben die neuen Wiederholungen +/− oder −/−, gilt die Prüfportion als negativ; Ergebnisse aller Prüfportionen müssen übereinstimmen — ist mindestens eine Portion positiv und eine andere negativ, wird die Analyse wiederholt; ergibt mindestens eine Wiederholung des gesamten Verfahrens ab der Extraktion ein uneindeutiges Ergebnis, soll der Bericht angeben, dass die Probe an der LOD negativ ist. Abschnitt 10: der Bericht nennt die Spezifität des Verfahrens (eventspezifisch, konstruktspezifisch oder Screening). Anhang A, neuer A.5 — reisspezifisches Verfahren (Saccharosephosphatsynthase-Gen SPS, Primer SPS F/SPS R, Amplikon 279 bp, konventionelle PCR mit Elektrophorese): Ringversuch des GMDL-SJTU von 2007, 12 Laboratorien; 1 falsch negatives Ergebnis bei 144 Reisproben (0,69 %) und 2 falsch positive bei 120 Proben anderer Pflanzen (1,67 %); LOD etwa 0,1 % Massenanteil Reis in Maismehl (bei 0,05 % und 0,01 % positive Ergebnisse nur in einem Teil der Laboratorien); CTAB-Extraktion nach ISO 21571:2005, A.3; Ansatz 30 µl, empfohlen 100 ng DNA je Reaktion; 35 Zyklen mit Anlagerung bei 58 °C; Agarosegel 20 g/l mit Ethidiumbromid 0,5 µg/ml, 5 V/cm, 20 min; DNA-Lösungen bei 4 °C höchstens eine Woche oder bei −20 °C. Neuer A.6 — tomatenspezifisches Verfahren (Gen LAT52), optimiert für Samen, Früchte, Ketchup, Saft und andere Erzeugnisse: Ringversuch von 2007, 13 Laboratorien; 1 falsch negatives bei 156 (0,64 %) und 4 falsch positive bei 130 (3,08 %), die nach dem Text auf Kontamination bei der PCR zurückgehen können; LOD im laborinternen Versuch mindestens 0,1 %.

STATUS (Stand 03.10.2026). In der PKN-Suche (Suchbegriff „21569“, 03.10.2026) hat PN-EN ISO 21569:2007 (polnische Fassung, „Führt ein: EN ISO 21569:2005 [IDT], ISO 21569:2005 [IDT]“) keinen Rückzugsvermerk; daneben das Zusatzelement PN-EN ISO 21569:2007/A1:2013-07 (englische Fassung). Karte: Veröffentlichung 16.01.2007, 71 Seiten, KT 287 Biotechnologie, ICS 67.050, „Ersetzt PN-EN ISO 21569:2005 – englische Fassung“, Zusatzelemente PN-EN ISO 21569:2007/A1:2013-07E, ohne Rückzugsvermerk. Im iTeh-Katalog (gelesen 03.10.2026) hat ISO 21569:2005 den Status „Published“, Stufe 90.92 (internationale Norm zur Überarbeitung), seit 29.08.2024; als überarbeitendes Dokument nennt die Karte ISO/TS 21569-10:2026, und die iTeh-Suche zeigt auch den Entwurf prEN ISO 21569-1.

WIE VIELE LABORATORIEN UND IN WELCHER FORM (Kopie der Datenbank der Akkreditierungsumfänge, Stand bis 17.09.2026, gelesen 03.10.2026). Die Nummer 21569 steht in 3 Datensätzen bei 3 Laboratorien: AB 465, AB 685, AB 868. In den aktuellen PCA-Dokumenten (gelesen 03.10.2026; AB 465 Ausgabe Nr. 31 vom 23.12.2025, AB 685 Ausgabe Nr. 19 vom 29.01.2026, AB 868 Ausgabe Nr. 21 vom 06.03.2026) steht die Norm in 3 Zeilen bei denselben 3 Laboratorien — in der Zeile von AB 685 kommt die Nummer 8-mal vor (Norm, Änderung A1:2013 und sechs Anweisungen IN-01–IN-06, Ausgabe 03 vom 29.12.2024); in jedem Dokument entspricht die Zahl der Seitenmarken der Zahl der PDF-Seiten, ohne Wiederholungen; die Durchsuchung aller am 03.10.2026 aus dem BIP heruntergeladenen PCA-Dokumente ergab keine Laboratorien außerhalb der Datenbankkopie. Form „PN-EN ISO 21569“ ohne Jahr mit Verfahren PBD-73.00.00 (AB 465), „PN-EN ISO 21569:2007“ und „PN-EN ISO 21569:2007/A1:2013“ mit Anweisungen (AB 685), „PN-EN ISO 21569“ zusammen mit PN-EN ISO 21570 (AB 868). Keine dieser Positionen ist ausgesetzt. Der Reiter „Laboratorien“ (Suchbegriff „PN-EN ISO 21569“) zeigt alle 3 Laboratorien — geprüft mit einer Reiterabfrage auf dem Produktivserver labcoda.pl am 03.10.2026.

WAS DIE LABORATORIEN PRÜFEN (Positionen bei PCA). AB 465: Futtermittel (flexibler Umfang) — Anwesenheit gentechnischer Veränderungen, Real-Time-PCR / PCR; AB 685: Futtermittel — Anwesenheit GVO-spezifischer Sequenzen: ctp2–cp4 epsps, nptII, bar, pFMV, pat, P-35S, T-nos, Real-Time-PCR; AB 868: landwirtschaftliche Erzeugnisse und Futtermittel (flexibler Umfang) — Anwesenheit und Gehalt gentechnischer Veränderungen, PCR, Real-Time-PCR, zusammen mit PN-EN ISO 21570.

WO LEICHT EIN SCHEINBAR RICHTIGES ERGEBNIS ENTSTEHT. Beim negativen Ergebnis: „kein GVO“ darf nicht geschrieben werden — nur „Zielsequenz Y nicht nachgewiesen“ mit LOD und Referenzmaterial, und mit Zusatz, wenn die DNA unzureichend gewesen sein kann (9.1, 9.2). Beim Screening-Element: der 35S-Promotor und andere Elemente aus natürlich vorkommenden Organismen (CaMV) können aus einer Infektion stammen, nicht aus einem GVO — die Anwesenheit anderer DNA dieses Organismus ist auszuschließen (7.6); AB 685 prüft P-35S. Bei verarbeiteter DNA: Abbau senkt die Nachweisbarkeit, und das Amplikon sollte 60–150 bp lang sein (7.1, 7.3.2). Bei Kontrollen: ohne Inhibitionskontrolle und Kontrollen gemäß ISO 24276 ist das Ergebnis weder positiv noch negativ (7.1, 8.1); zwei Prüfportionen müssen übereinstimmen (9.4). Bei der Matrix: die Norm wurde für Lebensmittel entwickelt und nennt Futtermittel als mögliche Anwendung (1) — alle drei Laboratorien prüfen Futtermittel. Bei abweichenden Ergebnissen: nach der Änderung A1:2013 ergibt eine Prüfportion mit +/− nach Wiederholung ein negatives Ergebnis, und ein uneindeutiges Ergebnis des wiederholten Verfahrens wird als negativ an der LOD angegeben (9.4 in der Fassung von A1) — ohne die Änderung verlangte der Text Übereinstimmung zweier Portionen und Wiederholung. Bei der Ausgabe: AB 685 wendet die Änderung A1:2013 an, AB 465 und AB 868 verweisen auf die Norm ohne Jahr.

WAS WIR NICHT ANGEBEN. Die Verfahren der Anhänge B–D (Screening, konstrukt- und eventspezifisch) und den Rest des Sojaverfahrens zitieren wir nicht — sie liegen außerhalb der Leseprobe. Den Rest von Abschnitt A.6 der Änderung A1:2013 und den Inhalt der ISO 24276 haben wir nicht gelesen. Kennzeichnungsschwellen für GVO aus Rechtsvorschriften geben wir nicht an.

Prinzip der Methode

Aus der Probe extrahierte DNA (ISO 21571) wird mittels PCR mit einem für die Zielsequenz spezifischen Primerpaar — taxonspezifisch, Screening-Element, konstrukt- oder eventspezifisch — in Zyklen aus Denaturierung, Primeranlagerung und Verlängerung amplifiziert. Das Produkt wird durch Gelelektrophorese oder fluoreszenzbasiert in der Real-Time-PCR nachgewiesen und durch Hybridisierung, Restriktionsverdau oder Sequenzierung bestätigt. Bei Kontrollen gemäß ISO 24276 lautet das Ergebnis „Zielsequenz nachgewiesen“ oder „nicht nachgewiesen“, mit auf ein Referenzmaterial bezogener Nachweisgrenze.

Anwendungen

• Qualitativer Nachweis von GVO und daraus hergestellten Produkten in Lebensmitteln; mögliche Anwendung auf Futtermittel und Pflanzenproben aus der Umwelt (1)
• Taxonspezifische (z. B. Sojalektin), Screening-, konstrukt- und eventspezifische Verfahren (Anhänge A–D)
• Futtermittel und landwirtschaftliche Erzeugnisse — Positionen in den Akkreditierungsumfängen von 3 Laboratorien bei PCA (PCR, Real-Time-PCR)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 21569:2007

Titel (PL)

Artykuły żywnościowe — Metody wykrywania organizmów zmodyfikowanych genetycznie i produktów pochodnych — Metody jakościowe oparte na kwasach nukleinowych

Title (EN)

Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. DNA-Extraktion

   Nach ISO 21571; Reinheit, wiederholbare Menge, Inhibitionskontrolle (7.1). PN-EN ISO 21569:2007 ohne Rückzugsvermerk im PKN (03.10.2026).

2. Wahl von Ziel und Primern

   Taxon, Screening-Element, Konstrukt oder Event; Amplikon an den DNA-Abbau angepasst (7.3, 7.4).

3. PCR mit Kontrollen

   Optimierung von MgCl2 und Temperaturprofil, Kontrollen nach ISO 24276, Referenzmaterialien (7.2, 7.5).

4. Nachweis und Bestätigung

   Elektrophorese oder Real-Time-PCR; Bestätigung durch Hybridisierung, Restriktion oder Sequenzierung; bei 35S Ausschluss von CaMV (7.6).

5. Ergebnis

   Positiv oder negativ bei konformen Kontrollen; Formulierung mit LOD; zwei Portionen übereinstimmend (8, 9).

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Arbeit mit DNA und PCR-Reagenzien — Schutz vor Kreuzkontamination (Aliquotieren, getrennte Bereiche)
• Elektrophorese — DNA-Farbstoffe und UV-Strahlung nach Sicherheitsdatenblättern

Häufige Fragen