🦠 Cryptosporidium und Giardia im Wasser — Kapselfiltration, immunmagnetische Separation und Immunfluoreszenzmikroskopie

Mikrobiologie ISO 15553

Übersicht

Cryptosporidium und Giardia sind parasitische Protozoen, die beim Menschen Darmerkrankungen hervorrufen. Beide Dauerformen — Oozysten und Zysten — überleben lange in der aquatischen Umwelt, und die Oozysten von Cryptosporidium sind gegen Chlor in den bei der Aufbereitung von Trink- und Badewasser verwendeten Konzentrationen widerstandsfähig. Aus diesem Grund ist, wie die Einleitung der Norm feststellt, das Fehlen vegetativer Indikatorbakterien für fäkale Verunreinigung kein Beweis für die Abwesenheit dieser Protozoen — das Ergebnis einer Untersuchung auf E. coli oder Enterokokken sagt über sie nichts aus.

ISO 15553:2006 beschreibt den Nachweis und die Bestimmung der Zahl von Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten in Oberflächen- und Grundwasser, in aufbereitetem Wasser, in Mineralwässern sowie in Bade- und Freizeitwasser. Das Verfahren erlaubt weder die Bestimmung bis zur Art noch die Feststellung des Wirts, aus dem sie stammen, noch die Beurteilung der Lebensfähigkeit oder der Infektiosität der gefundenen Formen; die Norm hält außerdem fest, dass die Untersuchung ausschließlich von erfahrenen Analytikern nach bestandenen Kompetenzprüfungen durchgeführt werden darf, die regelmäßig an dotierten Proben und in Eignungsprüfungen überprüft werden. Im Präparat können Objekte auftreten, die den Oozysten und Zysten morphologisch ähnlich sind — bei Zweifeln oder bei einem ungewöhnlich hohen Ergebnis empfiehlt die Norm, die Präparate Sachverständigen eines anderen Laboratoriums zur Beurteilung zu übergeben.

Die Norm ist nicht in den Bestand der Polnischen Normen übernommen worden — im PKN-Katalog gibt es keine nationale Übernahme, und polnische methodische Arbeiten (NIZP–PZH) führen ausdrücklich die ISO 15553:2006 an. Die geltende Verordnung des Gesundheitsministers vom 22. Mai 2026 über die Qualität des für den menschlichen Gebrauch bestimmten Wassers (Gesetzblatt 2026 Pos. 748) nennt weder Cryptosporidium noch Giardia unter den Parametern des Wassers oder unter den mikrobiologischen Parametern, für die Referenzverfahren angegeben sind; die Untersuchung wird also außerhalb des verbindlichen Umfangs durchgeführt, für die Zwecke der Risikobeurteilung und epidemiologischer Ermittlungen. Den früheren Rechtsstand beschreibt eine Arbeit des NIZP–PZH von 2012: die damals geltende Verordnung wies auf die Notwendigkeit einer Untersuchung auf Cryptosporidium sp. im Wasser aus Oberflächen- oder gemischten Fassungen hin, wenn im aufbereiteten Wasser Clostridium perfringens nachgewiesen worden war, wobei — wie die Verfasser festhalten — solche Untersuchungen in der Routineüberwachung in Polen nicht durchgeführt wurden. Die erste Ausgabe von 2006 bleibt geltend: ISO hat sie in einer systematischen Überprüfung am 22. März 2021 bestätigt, und eine weitere, am 15. Januar 2026 begonnene Überprüfung wurde am 5. Juni 2026 abgeschlossen — ihr Ausgang ist in der Lebenszyklus-Karte noch nicht vermerkt. Eine ersetzende Norm ist nicht genannt. Die Lebenszyklus-Karte stellt die Norm zugleich auf die STUFE 90.92, also „zu überarbeiten" — ebenso wie bei ISO 16200-1 in dieser Partie: die Norm ist weiterhin die laufende Fassung, aber ISO hat sie zur Überarbeitung überwiesen, weshalb es sich lohnt, beim Anführen in einer Verfahrensanweisung zu prüfen, ob eine neue Ausgabe erschienen ist. In den nach den Vorgaben dieser Norm durchgeführten Untersuchungen des NIZP–PZH an Wasser aus Oberflächenfassungen (Weichsel, Zegrze-Stausee) wurden Giardia-Zysten in allen Proben nachgewiesen (1,0–38,9 je 10 l) und Cryptosporidium-Oozysten in knapp der Hälfte der Proben (0,5–2,5 je 10 l).

DER POLNISCHE TITEL IN DIESEM EINTRAG IST UNSERE ARBEITSÜBERSETZUNG, kein amtlicher Titel: die Norm ist nicht in den Bestand der Polnischen Normen übernommen worden.

Prinzip der Methode

Die Isolierung der Protozoen aus dem Wasser erfordert eine Verringerung des Probenvolumens bei gleichzeitigem Zurückhalten der Oozysten und Zysten. Die Norm beschreibt zwei nacheinander ausgeführte Anreicherungsschritte: die Kapselfiltration mit Elution und danach die Zentrifugation mit geringer Drehzahl. Aus der angereicherten Suspension der Feststoffteilchen werden die Oozysten und Zysten durch immunmagnetische Separation (IMS) abgetrennt: sie binden an paramagnetische Kügelchen, die mit einem spezifischen Antikörper beschichtet sind, die Kügelchen werden mit einem Magneten von der nicht benötigten Substanz getrennt, wonach die Oozysten und Zysten mit Säure von den Kügelchen abgelöst und mit Lauge neutralisiert werden. Die abgetrennten Organismen werden mit einem an einen Fluorochrom gekoppelten monoklonalen Antikörper markiert (meist Fluoresceinisothiocyanat, FITC) und das Kernmaterial mit einem Nukleinsäurefarbstoff; das Präparat wird im Epifluoreszenzmikroskop mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC) betrachtet.

Anwendungen

• Überwachung von für den Gebrauch bestimmtem Wasser aus Oberflächen- und gemischten Fassungen (eine Untersuchung außerhalb des verbindlichen Umfangs des Gesetzblatts 2026 Pos. 748)
• Beurteilung der Wirksamkeit der Aufbereitung — Barrieren gegen chlorresistente Dauerformen
• Untersuchung von Oberflächen- und Grundwasser, das von Wasserwerken gefasst wird
• Bade- und Freizeitwasser (die Norm nennt sie im Anwendungsbereich ausdrücklich)
• Mineralwässer und aufbereitetes Wasser, das im Netz verteilt wird
• Epidemiologische Ermittlungen bei Verdacht auf einen Ausbruch einer wasserabhängigen Erkrankung

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

ISO 15553:2006

Titel (PL)

Jakość wody — Izolowanie i identyfikacja oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia z wody

Title (EN)

Water quality — Isolation and identification of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme

   Das Volumen nach der Art des Wassers und der geforderten Empfindlichkeit wählen: 10–100 l als Stichprobe, die ins Laboratorium gebracht wird, oder bis zu 1000 l, die am Ort der Probenahme filtriert werden. Bei großen Volumina die Kapsel gemäß der vom Hersteller angegebenen Durchflussrichtung in die Leitung einbinden, mit einem vor und nach der Probenahme abgelesenen Durchflussmesser; die empfohlenen Durchflüsse nicht überschreiten. Das Filtrieren von 1000 l kann bis zu 24 h dauern.

2. Transport und Aufbewahrung

   Stichproben und Filter im Dunkeln bei Umgebungstemperatur befördern. Im Laboratorium bei (5 ± 3) °C aufbewahren, wenn die Untersuchung nicht sofort beginnt. Einen gekühlten Filter vor Beginn der Elution auf Raumtemperatur bringen.

   🌡 Temperatur: (5 ± 3) °C

3. Elution des Filters

   Die Kapsel Envirochek STD senkrecht mit dem Entlüftungsventil nach oben aufstellen, beide Verschlusskappen abnehmen und das in der Probe verbliebene Wasser durch den Filter ablassen. Die untere Kappe aufsetzen, die Kapsel so mit Elutionspuffer füllen, dass er den Filter um etwa 1 cm bedeckt, verschließen und waagerecht bei 600 ± 25 Zyklen/min schütteln. Nach dem ersten Schütteln die Spülflüssigkeit in ein konisches 250-ml-Röhrchen umgießen, eine weitere Portion Puffer zugeben und erneut schütteln, dabei die Lage des Entlüftungsventils ändern.

   ⏱ Zeit: 2 × (5 min ± 30 s)

4. Zentrifugation und Messung des Sedimentvolumens

   Die vereinigten Spülflüssigkeiten bei 1100 × g 15 min lang ohne Bremsen in der Auslaufphase zentrifugieren. Unmittelbar nach dem Zentrifugieren das Sedimentvolumen ablesen. Überschreitet es den vom Hersteller des IMS-Sets empfohlenen Wert, die Probe in Teilproben aufteilen.

   ⏱ Zeit: 15 min

5. Absaugen des Überstands und Angleichen des Volumens

   Den Überstand mit der Pipette bei einem Unterdruck von weniger als 20 kPa absaugen und dabei 2–5 ml über dem Sediment belassen; bei nicht sichtbarem Sediment besondere Vorsicht walten lassen. Mit entionisiertem Wasser auf 9 ml auffüllen und 10–15 s vortexen. Die Suspension kann bis zur IMS bei (5 ± 3) °C aufbewahrt werden.

   ⏱ Zeit: 10–15 s Vortexen

6. Immunmagnetische Separation (IMS)

   Die Oozysten und Zysten an paramagnetische, mit einem spezifischen Antikörper beschichtete Kügelchen binden, die Kügelchen mit einem Magneten von der übrigen Substanz trennen und danach die Organismen mit Säure von den Kügelchen ablösen und vor der immunologischen Färbung mit Lauge neutralisieren.

7. Färbung des Präparats

   Die abgetrennten Organismen mit einem an ein Fluorochrom gekoppelten monoklonalen Antikörper (meist FITC) und das Kernmaterial mit einem Nukleinsäurefarbstoff (DAPI) markieren. Die Präparate in einer feuchten Kammer bebrüten und mit einem Immunfluoreszenz-Einbettmedium eindecken.

8. Mikroskopische Beurteilung

   Das Präparat im Epifluoreszenzmikroskop bei einer Gesamtvergrößerung von 1000× mit dem FITC-Filter (Anregung 480 nm, Emission 520 nm) und dem UV-Filter (350/450 nm) sowie im DIC-Kontrast durchmustern. Den Oozysten und Zysten morphologisch ähnliche Strukturen können falsch positive Ergebnisse liefern — bei Zweifeln oder bei einem ungewöhnlich hohen Ergebnis das Präparat Sachverständigen eines anderen Laboratoriums zur Beurteilung übergeben.

9. Qualitätssicherung und Wiederfindung

   Die Norm sieht gesonderte Verfahren der Qualitätssicherung (Abschnitt 8) sowie die Herstellung von Positivkontrollen und Wiederfindungsprüfungen (Anhang D) vor. In der Praxis des NIZP–PZH wurden Leitungswasserproben von 20 l Volumen mit einer eingewogenen Referenzsuspension dotiert (99 ± 1,4 Oozysten und 99 ± 1,6 Zysten), und daraus wurde die Wiederfindung berechnet.

10. Angabe des Ergebnisses

    Das Ergebnis wird als Zahl der Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten im untersuchten Wasservolumen angegeben (in polnischen Arbeiten meist je 10 l). Im Prüfbericht sind das Volumen des filtrierten Wassers und das verwendete Filtrationssystem zu vermerken, denn von ihnen hängt die Empfindlichkeit der Bestimmung ab.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Cryptosporidium und Giardia sind für den Menschen krankheitserregend (Darmerkrankungen) — Proben, Konzentrate und Referenzsuspensionen als infektiöses Material behandeln
• Cryptosporidium-Oozysten sind gegen Chlor in den zur Wasseraufbereitung verwendeten Konzentrationen widerstandsfähig — die Desinfektion mit Hypochlorit ist keine zuverlässige Art, Geräte nach der Arbeit mit diesem Material zu entkeimen
• Referenzsuspensionen bei (5 ± 3) °C aufbewahren und niemals einfrieren; verklumpte Suspensionen oder solche mit nachlassender Anfärbung nicht verwenden
• Die Untersuchung führen ausschließlich Analytiker nach bestandenen Kompetenzprüfungen durch, die regelmäßig an dotierten Proben und in externen Eignungsprüfungsprogrammen überprüft werden
• Methanol und die zum Fixieren der Präparate verwendeten Lösemittel — Arbeit im Abzug, fern von Zündquellen, mit Handschuhen und Schutzbrille

Häufige Fragen